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本研究将透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb)通过重叠延伸PCR(overlapping extension pcr,OE-PCR)技术置于枯草芽胞杆菌强启动子P43调控下,融合片段克隆到芽胞杆菌整合表达载体pDG1730中,得到重组整合载体pDG-P43vgb,利用重组整合载体中携带的芽胞杆菌a-淀粉酶(Alpha-amylase)基因上游和下游两个同源臂,通过双交换同源重组将P43启动子和vgb表达框整合到解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42染色体上的淀粉酶基因位点,通过菌落PCR和淀粉酶活性测定来筛选阳性整合子,得到了重组菌,命名为FZB42-VHb。
通过SDS-PAGE分析和Wsetern-Blot分析,发现重组菌FZB42-VHb表达了VHb。通过一氧化碳差光谱法来检测,证实重组菌FZB42-VHb表达了有活性的透明颤菌血红蛋白。为研究重组菌表达透明颤菌血红蛋白后对菌体的影响,本文从对菌体生长的影响和对代谢产物的影响两方面进行。
通过测定重组菌和原始菌的生长曲线发现,透明颤菌血红蛋白的表达对菌体生长有促进作用,使发酵液中最大菌体密度提高了14.49％,而且重组菌株中VHb的表达对抗菌脂肽(Antimicrobial lipopeptide)的产生有促进作用,相同培养条件下,抗菌脂肽芬荠素(Fengycin)的产量比原始菌株提高了1.74倍,抗菌脂肽表面活性素(Surfactin)的产量提高了3.14倍。
平板抑菌试验表明,工程菌的抗菌脂肽比等量原始菌株抗菌脂肽对立枯丝核菌的抑制效果提高了61.5％,对辣椒白绢病Sclerotium rolfsi的抑制效果提高了36.4％,对烟草赤星病菌Alternaria alternata的抑制效果提高了38.9％。
通过SDS-PAGE分析和Wsetern-Blot分析,发现重组菌FZB42-VHb表达了VHb。通过一氧化碳差光谱法来检测,证实重组菌FZB42-VHb表达了有活性的透明颤菌血红蛋白。为研究重组菌表达透明颤菌血红蛋白后对菌体的影响,本文从对菌体生长的影响和对代谢产物的影响两方面进行。
通过测定重组菌和原始菌的生长曲线发现,透明颤菌血红蛋白的表达对菌体生长有促进作用,使发酵液中最大菌体密度提高了14.49％,而且重组菌株中VHb的表达对抗菌脂肽(Antimicrobial lipopeptide)的产生有促进作用,相同培养条件下,抗菌脂肽芬荠素(Fengycin)的产量比原始菌株提高了1.74倍,抗菌脂肽表面活性素(Surfactin)的产量提高了3.14倍。
平板抑菌试验表明,工程菌的抗菌脂肽比等量原始菌株抗菌脂肽对立枯丝核菌的抑制效果提高了61.5％,对辣椒白绢病Sclerotium rolfsi的抑制效果提高了36.4％,对烟草赤星病菌Alternaria alternata的抑制效果提高了38.9％。