产氨短杆菌MA-2催化产L-苹果酸代谢初探及纯化分离研究

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L-苹果酸作为绿色安全的有机酸添加剂,应用领域覆盖食品、日用化工等,仅次于柠檬酸和乳酸。产氨短杆菌Brevibacterium ammoniagenes MA-2是一株高产延胡素酸酶的菌株,可催化合成L-苹果酸。在不同的发酵条件下,产氨短杆菌产延胡索酸酶、催化合成L-苹果酸能力不同。  本论文通过测定产氨短杆菌在三种不同培养基(A,B,C)下的菌体干重、催化L-苹果酸含量以及底物浓度,研究其发酵动力学过程。找出菌体对数生长期,生长曲线采用Logistic模型模拟,得到最大菌体干重;L-苹果酸合成的动力学采用Leudeking-Piret模型描述,找出主要影响因素;最后通过对底物消耗的动力学规律的Leudeking-Piret-Like方程模拟,评价碳源在三种不同条件下的消耗速率与利用率。结果表明,产氨短杆菌在蔗糖中生长周期长,对底物的利用效率高,菌体干重也最大,而在葡萄糖中生长周期较短,比生长速率高,且只有在A培养基中合成L-苹果酸。  通过差异蛋白质组学研究产氨短杆菌在不同碳源条件下差异表达,找出80个匹配点,其中表达量存在显著差异的有65个点,其差异主要体现在碳代谢过程上。以蔗糖为碳源时,微生物的自身生长及脂肪酸代谢得到促进,而L-苹果酸的合成却受到影响。以葡萄糖为碳源时,碳代谢得到加强,但高浓度水平下,微生物体为适应外界高渗透压等条件,加快能量传递和氨基酸生成,进而影响了L-苹果酸的合成。  对产氨短杆菌发酵催化所得L-苹果酸发酵液进行初步纯化分离研究,获得纯化分离参数。在洗脱流速5 mL/min、柱温30℃、洗脱体积350 mL时,D315阴离子大孔树脂分离工艺效果最佳。L-苹果酸在(水-乙醇)二元溶剂体系中的溶解度随着温度、体系中乙醇比率升高,呈现上升趋势,在体系中的溶解过程是吸热而非自发进行的反应,而焓变(热量变化)是溶解过程中起主要作用的因素。
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