【摘 要】
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与正常细胞不同,肿瘤细胞是一种变异的细胞,具有无限增殖、可转化和易转移等基本特征,肿瘤治疗是世界医学难题之一。目前,临床上肿瘤的治疗方法主要是放疗、化疗和手术治疗,在杀死肿瘤细胞的同时,也会引起正常组织细胞的损伤,毒副作用较大,靶向性差。本实验在前期研究的肿瘤抑素抗肿瘤活性7肽中引入VEGF类似物和碱性氨基酸序列,设计合成T-7VR肽。目的是加强肿瘤抑素7肽的靶向性和抗肿瘤活性。新合成的的T-7V
【基金项目】
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哈尔滨商业大学科研项目专项基金（17XN073）
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与正常细胞不同,肿瘤细胞是一种变异的细胞,具有无限增殖、可转化和易转移等基本特征,肿瘤治疗是世界医学难题之一。目前,临床上肿瘤的治疗方法主要是放疗、化疗和手术治疗,在杀死肿瘤细胞的同时,也会引起正常组织细胞的损伤,毒副作用较大,靶向性差。本实验在前期研究的肿瘤抑素抗肿瘤活性7肽中引入VEGF类似物和碱性氨基酸序列,设计合成T-7VR肽。目的是加强肿瘤抑素7肽的靶向性和抗肿瘤活性。新合成的的T-7VR肽分子量小,稳定性强,具有可特异结合肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞表面血管内皮生长因子受体的双重靶向,抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成双重抗肿瘤活性。其高效的抗肿瘤活性、较强的靶向性,对抗肿瘤药物的开发应用具有一定的指导意义。本课题选取人胃癌细胞（SGC-7901）、人肝癌细胞（Hep G2）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,探究T-7VR肽抗肿瘤活性、抗肿瘤血管生成活性,并从能量代谢角度研究其作用机制。实验通过MTT法检测T-7VR肽对SGC-7901、Hep G2、HUVEC三种细胞的增殖抑制率、IC50及浓度依赖性。台盼蓝染色法绘制生长曲线,研究T-7VR肽对SGC-7901、Hep G2、HUVEC三种细胞的增殖抑制作用及时间依赖性;HE染色法观察T-7VR肽作用后,细胞的形态学变化;Annexin V单染法,流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI单染法,流式细胞仪检测T-7VR肽对细胞周期的影响;分光光度试剂盒检测细胞糖酵解过程磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）活力,三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶（SDH）活力,能量代谢相关酶谷氨酰胺酶（GLS）活力及终产物乳酸（LD）和ATP含量变化;Western blot法检测细胞内缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、单羧基转运体-4（MCT-4）和葡萄糖转运体-1（GLUT-1）表达变化。MTT结果显示,T-7VR肽对SGC-7901、Hep G2、HUVEC细胞的IC50值分别为111.349μmol/L、119.761μmol/L、102.969μmol/L,T-7VR肽浓度在80μmol/L时对SGC-7901、Hep G2和HUVEC三种细胞的抑制率均接近40%,结合三种细胞的IC50值,最终选定T-7VR肽给药浓度为80μmol/L进行后续实验。生长曲线结果显示T-7VR肽对SGC-7901、Hep G2、HUVEC三种细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间依赖性,对Hep G2作用较强。PI单染法,流式细胞仪检测细胞周期,80μmol/L浓度T-7VR肽处理细胞48h后,与对照组比较,SGC-7901细胞G0/G1期百分率显著升高（P<0.01）,S期、G2/M期百分率显著下降（P<0.01）。Hep G2细胞G0/G1期、S期百分率显著升高（P<0.01,P<0.05）,G2/M期百分率显著下降（P<0.01）。HUVEC细胞G0/G1期百分率显著升高（P<0.01）,S期百分率显著下降（P<0.01）。T-7VR肽阻滞SGC-7901细胞、Hep G2细胞和HUVEC细胞G0/G1期,对Hep G2细胞S期也具有阻滞作用。HE染色法表明T-7VR肽作用SGC-7901、Hep G2、HUVEC三种细胞后,细胞数量明显减少,细胞形态发生改变。酶及代谢产物检测结果显示,80μmol/L浓度的T-7VR肽处理细胞48h后,与对照组相比,SGC-7901中PFK、PK显著下降（P<0.01）SDH活力和GLS活力变化不大,胞外LD、ATP显著下降（P<0.01）;Hep G2中PFK活力、PK活力显著下降（P<0.01）,SDH活力明显下降（P<0.05）,GLS活力无明显变化,胞外LD、ATP显著下降（P<0.01）。HUVEC细胞中PK活力显著下降（P<0.01）,PFK活力、SDH活力和GLS活力变化不大,胞外LD、ATP显著下降（P<0.01）。说明T-7VR肽对SGC-7901的糖酵解作用较强,对Hep G2糖酵解和有氧氧化都具有抑制作用,对HUVEC只影响糖酵解作用,其可引起三种细胞LD、ATP含量降低。Western blot结果显示,与对照组比较,SGC-7901中GLUT-1和MCT-4表达显著下降（P0.05）;Hep G2中HIF-1α、MCT-4表达显著下降（P<0.01）,GLUT-1蛋白表达明显下降（P<0.05）;HUVEC中HIF-1α、MCT-4和GLUT-1表达下降（P<0.01）。说明T-7VR肽可引起三种细胞的MCT-4表达下降,对GLUT-1和HIF-1α表达具有不同程度的抑制作用。实验结果表明T-7VR肽通过影响三种细胞能量代谢相关蛋白的表达,进而影响能量代谢相关酶活力和代谢产物含量,降低能量ATP的生成,抑制三种细胞增殖和促进细胞凋亡,达到抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管生成作用,但其对三种细胞能量代谢相关蛋白、代谢酶、增殖抑制影响程度不同,具有一定的细胞特异性。
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