论文部分内容阅读
目前关于费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia,Ph+ALL）的治疗还需要不断的进行探索,已有的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）在治疗Ph+ALL时的作用时间比较短暂,而且会出现耐药性,因此我们需要找到能够增加TKIs活性的药物。B细胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma 2,BCL-2）在大多数血液肿瘤（包括Ph+ALL）中高表达,因为其具有抗凋亡的作用,所以能够诱导肿瘤的发生。维奈托克（Venetoclax,VEN）作为一种特异性的BCL-2抑制剂,因此在治疗血液肿瘤时能够起到很好的作用,已经被证实在慢性髓系白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）、急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）、套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）中能够取得很好的治疗效果,且已证实与TKIs联用可起协同作用,但该药针对急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）的相关研究较少,尤其针对Ph+ALL。本论文主要就维奈托克与达沙替尼联用在Ph+ALL细胞株中的效果及其相关机制进行探讨。目的:探讨BCL-2抑制剂-维奈托克（VEN）、酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）达沙替尼（Dasatinib,DAS）单独去使用以及对两药进行联合使用,观察其对SUPB15细胞的增殖情况与凋亡反应及其相关机制。方法:（1）96孔板进行体外培养的SUPB15细胞经VEN（VEN单药组）、DAS（DAS单药组）、两药联合（DAS+VEN联合用药组）,进行干预,并设置不加药阴性对照组,每组设置6个重复孔,观察SUPB15细胞株24h、48h、72h,使用CCK8法测定细胞增殖抑制率。（2）采用流式细胞术（FCM）在48h时间节点检测DAS组、VEN组及两药联合组的凋亡情况。（3）Q-PCR检测DAS单药组、VEN单药组及两药联合作用干预SUPB15细胞株后,相关基因BCR-ABLm RNA、BCL-2m RNA、MCL-1m RNA、LYNm RNA、BIMm RNA、STAT5m RNA、BAXm RNA表达。（4）采用蛋白质检测法（Western-blot）分析DAS单药组、VEN单药组及两药联合使用组对SUPB15细胞株干预后,相关蛋白BCL-2、MCL-1、STAT5、BAX、BIM、LYN蛋白的表达情况以及检测凋亡相关的标志性蛋白Cleaved-Caspase-3（CC-3）的水平。结果:（1）CCK-8结果表明:在24h、48h、72h三个时间节点,VEN单药组（0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L）,DAS单药组（0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）。伴随着时间延长以及浓度的增加,利用酶标仪检测到的吸光值越来越低,说明药物作用于细胞之后,细胞的存活率降低,药物对细胞的抑制率升高,且呈时间-剂量依赖性,单药作用组与联合作用组与对照组比较差异均具有统计学意义。DAS单药组在各时间点（24h、48h、72h）的IC50值分别为0.13μmol/L、0.08μmol/L、0.01μmol/L,VEN单药组在各时间点（24h、48h、72h）的IC50值分别为:1.24μmol/L、0.39μmol/L、0.07μmol/L。计算在48h VEN联合DAS（0.5μmol/L+0.1μmol/L）的q值为1.16,q值＞1.15,表明两药具有协同或增敏作用。（2）FCM结果表明:根据CCK8实验结果,选用48h时间节点,选接近IC50值的联合组研究浓度,即:DAS 0.1μmol/L、VEN 0.5μmol/L及两药联合。流式仪检测细胞凋亡率,联合用药组的平均凋亡率（57.42±0.59）%,显著高于对照组,亦高于各单药组（p＜0.05）,差异具有统计学意义。（3）Q-PCR结果表明:当DAS单药组浓度为0.1μmol/L、VEN单药组浓度为0.5μmol/L及联合组浓度为0.1μmol/L DAS+0.5μmol/L VEN时,干预SUPB15细胞株48h后,相关基因BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的相对表达量较对照组下降（P值＜0.05,差异具有统计学意义）,而BIM、BAX m RNA的相对表达量较对照组上升,联合用药组与单药组比较BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的下降量及BIM、BAX m RNA的上升量更明显,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（4）Western-blot结果表明:单药组（0.1μmol/L DAS、0.5μmol/L VEN）及联合组（0.1μmol/L DAS+0.5μmol/L VEN）干预SUP15细胞株48h,与对照组比较,LYN、BCL-2、MCL-1、STAT5蛋白的表达量下降,而BAX、BIM以及CC-3表达增加,联合用药组的LYN、MCL-1、BCL-2蛋白与单药组相比显著下降（P＜0.05）;联合用药组中STAT5的表达较VEN单药组明显下降,与DAS单药组比较虽无统计学意义（P＞0.05）,但具有一定下降趋势;与对照组相比,BAX蛋白、BIM蛋白以及CC-3的表达在各实验组中均明显升高（P＜0.05,差异有统计学意义）,联合用药组的BAX的表达与各单药组比较有显著差异（P＜0.05）,联合组BIM的表达虽不具统计学差异（P＞0.05）,但是具有一定的增加趋势。结论:（1）VEN、DAS单药对SUPB15细胞株均有增殖抑制作用,并呈时间剂量依赖性;（2）VEN、DAS单药对SUPB15细胞株均有促凋亡作用;（3）VEN与DAS联用干预SUP15细胞株具有协同抑制作用作用和促进凋亡,可能的机制为DAS可以下调MCL-1的表达,上调BAX、BIM,从而增强VEN的作用效果。