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目的:1.研究肥胖指数与肾病高危因素之间的相关性。2.研究脂毒性对肾脏的影响。3.探讨胰高血糖素样肽-1受体激动剂(glucagon-like peptide-1 receptor agonist,GLP-1RA)对肾脏脂毒性的保护效果及沉默信息调节因子1(sirtuin 1,SIRT1)在其中的介导作用。方法:一、肥胖与非肥胖人群的肥胖指数与肾病高危因素相关性研究随机选取肥胖患者30例(肥胖组)及健康人员30例(非肥胖组)。空腹测定临床指标即身高体重比(body mass index,BMI)、腰臀围比(waist-to-hip ratio,WHR)、腰高比(waist-to-height ratio,WHtR)、血压;生化指标即甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、血糖、肌酐、尿酸。二、脂毒性对小鼠肾脏的影响及GLP-1RA对其保护作用研究将C57BL/6J小鼠随机分为正常组(NS组)、高脂组(HF组),利拉鲁肽组(L组)、艾塞那肽组(E组)、辛伐他汀组(S组)。NS组予以普通饲料喂养,余各组予以高脂饲料喂养。待高脂模型造成后,NS组和HF组予以生理盐水,余各组分别予以利拉鲁肽、艾塞那肽、辛伐他汀。NS组继续予以普通饲料喂养,余各组予以高脂饲料喂养。干预至20周末收取各组肾脏标本,HE、PAS、Masson染色观察肾组织病理变化以及免疫组化检测肾组织SIRT1表达水平。三、脂毒性对人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cell,HK-2)的影响及GLP-1RA对其保护作用研究1.棕榈酸对HK-2细胞脂质沉积和细胞活力的影响:设置不同的棕榈酸干预浓度梯度(0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L)和时间梯度(12h、24h、48h)孵育细胞,同时设置正常组(NS组)。油红O染色和结晶紫染色观察脂毒性对细胞的影响。2.艾塞那肽和SIRT1抑制剂EX527对高脂诱导HK-2细胞活力的影响:实验分组为NS组、高脂组(PA 组)、高脂+不同浓度(10nmmol/L、100nmmol/L、1000nmmol/L)艾塞那肽组(PA+LE组、PA+ME组、PA+HE组)、高脂+艾塞那肽+EX527组(PA+ME+EX组)。CCK-8法观察各组细胞增殖活性。3.艾塞那肽和EX527对高脂诱导HK-2细胞脂质沉积和SIRT1表达的影响:实验分组为NS组、高脂组(PA组)、高脂+艾塞那肽组(PA+E组)、高脂+艾塞那肽+EX527组(PA+E+EX组)。油红O染色观察脂质沉积变化;Western Blot检测各组SIRT1蛋白的表达。结果:一、肥胖与非肥胖人群的肥胖指数与肾病高危因素之间的相关性1.肥胖组的 BMI、WHR、WHtR、TC、TG、HDL、LDL、尿酸(P<0.01)及收缩压、舒张压、空腹血糖(P<0.05)明显高于非肥胖组;但两组肌酐水平无明显统计学差异。2.肥胖组的WHtR与收缩压、LDL呈正相关(r=0.499、0.493,P<0.01);与舒张压、TG、TC 及尿酸呈正相关(r=0.460、0.432、0.364、0.458,P<0.05);与 HDL 呈负相关(r=0.464,P<0.05)。而非肥胖组的WHtR则与上述指标无明显相关性。二、脂毒性对小鼠肾脏的影响及GLP-1RA对其保护作用1.高脂饮食及药物干预对小鼠体重的影响:实验前,各组间小鼠体重未见明显统计学差异;高脂饮食后,HF组体重明显高于NS组,药物干预后,HF组体重明显高于L组、E组及S组(P<0.01)。而L组、E组及S组之间无明显统计学差异。2.高脂饮食及药物干预所致小鼠肾组织形态学和SIRT1表达的变化(1)定性比较:HE、PAS及Masson染色提示NS组的肾组织未见明显异常,而HF组肾小球肥大、基底膜增生明显,系膜区增生,系膜基质明显增厚、肾内血管管壁纤维化、核大、肾上管上皮细胞胞质肿胀,且出现炎性浸润现象,经GLP-1RA和辛伐他汀干预后,上述病理变化有所改善,但S组的肾上管上皮细胞胞质肿胀改善不明显。(2)定量比较:各组小鼠肾小球面积、系膜基质面积及肾小球系膜基质分数结果提示HF组高于NS组、L组、E组及S组(P<0.01);而L组、E组肾小球面积均小于S组(P<0.01);E组肾小球系膜基质面积小于S组(P<0.01);余各组间两两对比均无明显统计学差异。(3)肾组织SIRT1表达:免疫组化染色提示HF组肾小球和肾小管内SIRT1表达均低于NS组、L组、E组及S组(P<0.01);L组、E组肾小球和肾小管内SIRT1表达均高于S组(L组、E组的肾小球和肾小管内阳性表达率vs S组,P<0.01;L组肾小球内的SIRTlIOD vs S组,P<0.05;L组、E组肾小管内的SIRT1IOD vs S组,P<0.01);而L组与E组之间对比无明显统计学意义。三、脂毒性对HK-2细胞的影响及GLP-1RA对其保护作用1.棕榈酸对HK-2细胞脂质沉积和细胞活力的影响PA组细胞由圆形变为梭形,且细胞间连接变得松散;油红O染色后PA组细胞胞浆内出现红染脂滴颗粒。随着棕榈酸浓度的增加及作用时间的延长,其变形作用及细胞内脂滴沉积更明显。各组以细胞相对数量计算的细胞活力结果提示:作用12h时,各组较NS组无明显差异;作用24h时,0.2mmol/L、0.5mmol/L组较NS组无明显差异,其他组均低于 NS 组(0.6mmol/L 和 0.7mmol/L 组 vs NS 组,P<0.05;0.8mmol/L 和1.0mmol/L组vs NS组,P<0.01);作用48h时,0.2mmol/L组较NS组无明显差异,余各组均低于NS组(P<0.01)。结晶紫染色结果与油红O染色中细胞活力结果类似。2.艾塞那肽和EX527对高脂诱导HK-2细胞活力的影响CCK-8法测定各组OD值结果提示,NS组(P<0.01)、PA+LE组(P<0.05)及PA+ME组(P<0.01)均较PA组有所增加,但PA+HE组较PA组有所降低(P<0.05);其中PA+ME组的OD值最高。再经EX527干预后,PA+ME+EX组的OD值较PA+ME组降低(P<0.05)。3.艾塞那肽和EX527对高脂诱导HK-2细胞脂质沉积和SIRT1表达的影响(1)油红O染色:各组中单个细胞脂质积累量结果提示PA组高于NS组、PA+E组(P<0.01),PA+E+EX 组高于 PA+E 组(P<0.05)。(2)Western Blot实验:各组中SIRT1蛋白表达量结果提示PA组低于NS组、PA+E组(P<0.01),PA+E+EX 组低于 PA+E 组(P<0.01)。结论:1.肥胖与肾病的高危因素密切相关。2.高脂饮食喂养可导致小鼠肥胖、引起肾脏病变;棕榈酸可导致HK-2细胞脂质沉积、抑制细胞活力。3.利拉鲁肽和艾塞那肽可改善脂毒性对肾脏的损害,可能是通过SIRT1发挥作用。而辛伐他汀有类似的作用。