【摘 要】
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樱桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill）,一年生草本植物,是全球范围内种植面积最大的果蔬之一,现在已经发展成为一种重要的转基因模式植物,具有很高的经济价值和广阔的市场前景。番茄感染番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）后叶片黄化卷曲,果实变小畸形,产量大幅下降,严重影响了我国番茄产业和农业经济的发展。使用化学、物理、生
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樱桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill）,一年生草本植物,是全球范围内种植面积最大的果蔬之一,现在已经发展成为一种重要的转基因模式植物,具有很高的经济价值和广阔的市场前景。番茄感染番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）后叶片黄化卷曲,果实变小畸形,产量大幅下降,严重影响了我国番茄产业和农业经济的发展。使用化学、物理、生物等传统防治方法代价大、成本高且不能完全控制TYLCV,因此利用基因工程手段防治病毒成为新的对应策略。人工miRNA（artificial miRNA,amiRNA）技术是利用植物内源miRNA基因沉默的特性,将miRNA序列替换为amiRNA抑制靶基因表达。TYLCV由6个功能基因编码,其中复制蛋白基因C1编码的蛋白质是病毒开启复制所需的关键蛋白。故可利用amiRNA技术沉默TYLCV的复制蛋白基因（TYLCV-C1）来提高番茄抗病性。前期研究发现拟南芥组织培养中出现的大量差异表迖基因与“植物激素信号转导”通路密切相关,因此本文首先利用不同激素配比(2 mg·L-1 6-BA/ZT+0/0.1/0.2/0.3 mg·L-1 IAA)对樱桃番茄材料‘J6’脱分化、再分化最佳条件及关键调控基因进行筛选,从而建立其离体再生最佳体系。然后构建沉默TYLCV-C1的amiRNA表达载体并进行遗传转化,最后分析鉴定获得的转基因植株的抗病性,从而开展番茄黄化曲叶病毒DNA复制蛋白基因（TYLCV-C1）的沉默研究。取得以下结果:（1）建立了樱桃番茄材料‘J6’的最佳离体再生体系并筛选出了主要调控基因。结果表明,以‘J6’的子叶为外植体,在2 mg·L-1玉米素（ZT）+0/0.1 mg·L-1生长素（IAA）的激素配比下效果较好,脱分化率均达到100%,再分化率分别为67.00%和58.00%。脱分化基因Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1、Solyc04g054910.3.1和再分化基因Solyc05g013540.1.1、Solyc02g022850.1.1、Solyc08g066840.3.1和Soly C10g052510.2.1与子叶离体再生过程密切相关。（2）构建了沉默TYLCV-C1的amiRNA表达载体并进行了遗传转化。使用巢氏PCR扩增将拟南芥mi R319a中的miRNA替换成特异性沉默番茄中TYLCV-C1基因amiRNA,连接表达载体得到干扰表达载体p CPBI121-ami R-TY-C1。采用农杆菌介导法将干扰表达载体遗传转化至番茄子叶,经PCR鉴定共得到48株转基因阳性植株,阳性率为87.27%。（3）转基因植株抗病性鉴定结果表明:与野生健康植株相比,转基因植株株高矮化不到1/4,顶部枝桠轻微畸形,叶片轻花化,综合病情指数为9.17,抗性评价为抗病;其过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解胺酶（PAL）活性和丙二醛（MDA）含量无显著变化,光合指标和叶绿素荧光参数的破坏程度较小,光合作用基本能够正常进行,病毒基因中仅C4表达量出现上调。野生接病植株株高矮化了1/4-1/3,顶部枝桠严重畸形,叶片严重皱缩,野生番茄感病后综合病情指数高达53.33,抗性评价为感病。其过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解胺酶（PAL）的活性显著降低,丙二醛（MDA）含量显著上升,光合指标和叶绿素荧光参数受到破坏,病毒基因C4、V1和V2表达量显著上调（P＜0.05）。
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