【摘 要】
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水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物之一,水稻生产关系到我国的粮食安全。随着人口增长、全球气候变暖、耕地面积和水资源减少,我国水稻生产仍然面临着严峻挑战。CRISPR/Cas9系统介导的同源重组修复可对靶标基因进行定点敲除、插入等,快速实现优异等位基因精准替换,大大缩短育种周期。但精准的同源重组修复在植物中的效率偏低,限制了其在作物育种中的进一步应用。在人类细胞中的相关研究表明,
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水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物之一,水稻生产关系到我国的粮食安全。随着人口增长、全球气候变暖、耕地面积和水资源减少,我国水稻生产仍然面临着严峻挑战。CRISPR/Cas9系统介导的同源重组修复可对靶标基因进行定点敲除、插入等,快速实现优异等位基因精准替换,大大缩短育种周期。但精准的同源重组修复在植物中的效率偏低,限制了其在作物育种中的进一步应用。在人类细胞中的相关研究表明,由一个nCas9缺口酶和一对邻近反向gRNA构成的CRISPR/nCas9系统可在靶标基因上产生错位双链断裂,实现精准同源重组修复。同时CRISPR/nCas9系统介导的同源重组修复还能够规避单个靶点的同源序列引起的脱靶编辑,但在植物中尚未有利用CRISPR/nCas9系统进行同源重组修复的相关报道。本研究以水稻OsALS基因为靶标基因,设计进行同源重组修复的供体模板,利用tRNA连接供体模板与gRNA,以tRNA自剪切系统释放出的RNA转录本作为同源重组的修复模板,构建CRISPR/nCas9系统介导的同源重组修复载体;利用基因枪法介导的遗传转化,转化水稻品种中花11愈伤,经植物组织培养获得再生植株;通过设计基因组特异性引物,PCR扩增靶位点,经酶切鉴定和Sanger测序,进行基因型分析;进一步预测靶序列脱靶位点,设计特异性引物PCR扩增测序,对编辑株系进行脱靶分析,最终成功在水稻中实现了CRISPR/nCas9介导的水稻内源基因OsALS精准替换。在转化的165个水稻愈伤中,共获得132棵编辑单株,其中发生精准同源重组修复的水稻植株有104株,发生部分同源重组的水稻植株共有28株。对编辑株系进行检测发现,在T0代即获得了发生精准同源重组编辑的无转基因纯合株系。进一步脱靶分析显示,预测的3个脱靶位点均未发生脱靶编辑。CRISPR/nCas9系统介导的同源重组修复体系建立,为水稻精准设计育种提供了技术支撑。
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