缺血性脑损伤具有复杂的病理生理过程,涉及多种损伤及修复机制。中枢神经系统中小胶质细胞对所处微环境、不同刺激信号产生差异应答,表现出不同的功能表型M1型、M2型,小胶质细胞这种极化行为在脑缺血损伤中发挥着“双刃剑”的作用,表型的极性可能加重损伤或促进修复。激活素A(activinA,Act A)作为转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族中成员之一,其受体和结合蛋白广泛分布于脑组织,缺血性脑损伤可引起Act A的表达上调,通过激活不同的信号通路,表现神经保护活性,参与神经元损伤后修复。Act A可能是调控小胶质细胞极化行为的重要因子,但其机制尚不清楚。本研究为探讨缺血性脑损伤小胶质细胞极化规律及Act A参与调节小胶质细胞极化的可能机制,通过体内实验进行大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血损伤模型,体外实验建立小鼠小胶质细胞(BV2)氧糖剥夺/复氧(oxygenand glucose deprivation/repoxygenation,OGD/R)模型,根据缺血/缺氧不同时间点进行分组,检测Act A/Smads信号通路、小胶质细胞表型在缺血性脑损伤中的表达变化,并研究激活素A干预小胶质细胞极化的变化趋势。本研究包括以下内容:1.局灶性缺血性脑损伤中Act A/Smads信号通路的表达变化目的:检测不同缺血时间点Act A/Smads信号通路各位点活化情况。方法:应用Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO),选取不同缺血时间点(0d、1d、3d、5 d、7 d及14 d)并进行随机分组,采用改良神经功能缺损严重程度量表(modifiedneurological severity score,mNSS)评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,HE染色评价梗死后病理变化,实时荧光定量PCR、Western blot法检测脑组织内Act A/Smads通路相关跨膜受体(ActRⅡ)、受体下游因子(Smad2)基因及蛋白的表达水平。结果:MCAO局灶性脑缺血模型建立后,神经功能学评分提示存在明显的功能缺损,随缺血时间延长,评分逐渐降低;TTC染色可见明显的脑梗死病灶,随缺血时间延长,梗死脑组织体积逐渐降低;脑组织冠状位切片HE染色可见皮质梗死核心区大量神经元细胞坏死,细胞核固缩、核仁显示不清;Act A/Smads信号通路中Act A、Act AⅡ型受体及受体复合物中Smad2分别在基因及蛋白水平表达升高,随着缺血时间的延长,在缺血后3-5 d达到表达高峰,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:缺血性脑损伤可诱导Act A表达,上调Act A/Smads信号通路中跨膜受体、受体下游因子基因及蛋白水平的表达,Act A/Smads信号通路参与了缺血性脑损伤过程,缺血3-5 d表达达到高峰,为后续探讨Act A/Smads信号通路与小胶质细胞在缺血性脑损伤中的关系奠定了实验基础。2.局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化研究目的:研究缺血性脑损伤不同缺血时间点小胶质细胞表型变化规律。方法:建立大鼠MCAO模型,选取不同缺血时间点(0d、1 d、3d、5 d、7d及14d)将实验大鼠进行随机分组,实时荧光定量PCR检测M1型小胶质细胞标志物(iNOS、CD86)、M2型小胶质细胞标志物(CD206、Arg-1)基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物(iNOS、CD86)、M2型标志物(CD206、Arg-1)蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD的百分比。结果:实时荧光定量PCR结果显示缺血1 d组M1型小胶质细胞标志物(iNOS、CD86)及M2型小胶质细胞标志物(CD206、Arg-1)mRNA均处于低表达水平,iNOS基因表达水平从MCAO 3d开始逐渐升高,在缺血14d内保持升高的趋势;CD86基因表达水平在MCAO 5 d达到表达高峰后水平逐渐降低,MCAO 14 d时其表达水平接近缺血损伤初期表达水平;M2型小胶质细胞标志物CD206和Arg-1的基因表达趋势相同,二者均在MCAO 1-3 d内表达,在损伤3 d时达到表达高峰,随缺血时间延长,CD206、Arg-1表达水平逐渐降低;免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果变化趋势基本一致。与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:缺血性脑损伤可诱导小胶质细胞的极化,缺血早期以M2型为主,后期以M1型为主,提示了早期缺血诱导的小胶质细胞M2型极化,可能介导吞噬、抗炎作用,而后期M1型极化,可能介导慢性炎症损伤作用。3.Act A对局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化的影响目的:研究Act A对缺血性脑损伤小胶质细胞极化趋势的影响。方法:建立大鼠MCAO模型,选取缺血损伤3d时间点,在MCAO造模6小时后侧脑室微量注射不同浓度的Act A,随机分为假手术组、MCAO 3 d组、MCAO 3 d+Act A2.5 μg/kg 组及 MCAO 3 d+Act A 7.5 μg/kg 组。通过 mNSS 评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,实时荧光定量PCR检测Act A/Smads信号通路中Smad3、ActRⅡ基因水平、M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD百分比;结果:mNSS评价缺血性脑损伤后神经功能缺损结果显示Act A干预组评分明显优于MCAO 3 d组,Act A7.5μg/kg组评分优于Act A2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义(P<0.05);TTC染色测定结果显示干预组脑梗死体积明显小于MCAO 3 d组,ActA7.5μg/kg组小于ActA2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示,M1型标志物iNOS基因在MCAO 3 d组表达升高,Act A干预后表达水平降低,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组<MCAO 3 d+Act A 2.5μg/kg 组<MCAO 3 d 组;M2 型标志物 CD 206 基因 MCAO 3 d 组表达高于假手术组,Act A干预后CD206基因表达水平升高,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组>MCAO 3 d+Act A2.5μg/kg 组水平>MCAO 3 d 组;Smad 3、ActR Ⅱ基因表达结果显示干预组水平高于MCAO 3 d组,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg组高于MCAO 3 d+ActA2.5μg/kg组。差异有统计学意义(P<0.05)。结论:局灶性缺血性脑损伤后不同浓度Act A的干预,可减轻神经功能损伤程度、缩小脑梗死体积,促进Act A/Smads信号通路的表达,上调M2型标志物CD206的表达,下调表M1型标志物iNOS的表达,效应与干预浓度具有正相关性。Act A/Smads信号通路的活化可诱导小胶质细胞表型从M1型向M2型转化,这种变化可能发挥抗缺血损伤作用,为缺血性脑损伤的治疗提供潜在的转化靶点。4.Act A对小胶质细胞体外OGD/R过程中M1、M2型表达的影响目的:研究小鼠小胶质细胞BV2细胞OGD/R过程中不同时间点M1、M2型标志物、信号通路关键靶点的表达情况及Act A干预对M1、M2型表达的影响。方法:BV2细胞复苏后常规培养(高糖DMEM培养基,37℃、5%CO2)传代至第3代,通过更换无糖DMEM培养基、三气培养箱低氧培养(94%N2、5%CO2、1%O2),建立BV2细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,将细胞分为对照组、OGD 1 h/R0h、OGD 1 h/R3 h、OGD 1 h/R6h、OGD 1h/R12h五组,Western blot对M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10及Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达水平进行检测;选择OGD1 h/R6h时间点,给予不同浓度Act A预培养BV2 细胞,分为对照组、OGD 1h/R6h 组、OGD 1h/R6h+Act A30nM组及OGD 1 h/R6h+Act A30nM组共四组,进一步Western blot检测各组M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10的表达情况及Smad2蛋白水平的表达情况。结果:体外实验成功培养BV2细胞并建立BV2细胞OGD/R模型,WesterBlot结果显示随复氧时间的延长,Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达逐渐增加,M1型标志物iNOS蛋白表达逐渐增加,M2型标志物IL-10蛋白表达逐渐增加,与R6 h达到高峰后表达水平有所回落;Act A预处理BV2小胶质细胞后,与OGD 1h/R 6 h组比较干预组Smad2蛋白表达逐渐增加,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM组高于OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M1型标志物iNOS蛋白表达干预组低于OGD 1 h/R 6 h 组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组低于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M2型标志物蛋白水平表达逐渐升高,干预组高于OGD 1 h/R6 h组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组高于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM 组。结论:Act A可通过上调Act A/Smads信号通路中下游因子Smad2蛋白水平的表达,从而发挥神经保护作用,这一过程也参与调控了氧糖剥夺条件下BV2细胞极化过程,提示了 Act A/Smads信号通路可能通过调控小胶质细胞表型变化从而影响神经元细胞在缺血性损伤中的转归。