烟草青枯病是我国主要烟区烟草生产中的重要土传病害之一,给烟叶生产造成毁灭性的打击。目前化学防治是植物病害主要的防治措施,但化学药剂的大量持续性施用不仅造成病原菌抗药等难以克服的问题,还不利于生态环境的保护和农业的可持续发展,而采用植物根际细菌来防治病害的方法日益受到关注。本研究以烟草青枯病菌为靶标,从健康烟草土壤中进行拮抗细菌的分离、筛选及鉴定,利用盆栽试验研究拮抗细菌对烟草青枯病的防治效果及对烟草生长的影响。在此基础上,通过趋化性、生物膜成膜等试验研究烟草的根系分泌物和根组织成分对拮抗菌定殖的影响,初步阐明拮抗菌在烟草植株中的生防机制和定殖特征。本项研究可进一步丰富烟草青枯病的生防资源,为进一步开发利用优良的生防菌株提供理论依据。主要研究结果如下:1、利用稀释涂布法对安徽省黄山及宣城烟区的健康烟株根际土壤进行根际细菌的分离纯化,获得抑菌圈直径分别为16.64 mm和18.90 mm的根际细菌GZYCT-4和GZYCT-9。通过分子鉴定确定GZYCT-4和GZYCT-9均为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）,均具有合成脂肽类物质的能力。2、采用盆栽抗病试验和促生实验,发现经拮抗根际细菌GZYCT-4和GZYCT-9处理的不同烟草品种可有效地防控烟草青枯病,GZYCT-4处理的红花大金元烟株对青枯病的防效达到了51.83%,GZYCT-9处理的K326烟株对青枯病的防治效果达到58.62%;此外,上述两种生防菌均能促进烟草幼苗的生长,经GZYCT-9处理的烟草植株第10d、25d、45d的促生增长率分别为34.29%、27.69%、20.03%,GZYCT-4处理的烟草植株第10d、25d、45d的促生增长率分别是11.43%、22.5%、17.43%。3、利用趋化性、生物膜成膜试验研究了红花大金元和K326两种烟草品种的根系分泌物对拮抗菌和烟草青枯病菌定殖的影响。HPLC对不同品种烟草根系分泌物的检测结果表明红花大金元和K326两个烟草品种的根系分泌物均可产生草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸。其中,草酸对GZYCT-4的吸引作用最大,达到了61.50×10~4 cfu/m L-1;柠檬酸对GZYCT-9吸引作用最大,达到了34.00×10~4 cfu/m L-1,然而这四种有机酸对青枯均无趋化作用。生物膜测定结果可知,来自抗性品种的K326的根系分泌物比红花大金元的根系分泌物更能促进GZYCT-4、GZYCT-9及青枯菌生物膜的形成。进一步研究发现,苹果酸、草酸、柠檬酸能有效促进GZYCT-4和GZYCT-9生物膜的形成,而对于青枯病菌生物膜形成起到促进作用的仅有柠檬酸。4、利用趋化性、生物膜成膜试验研究了红花大金元和K326两种烟草品种的根组织提取物对拮抗菌定殖的影响。其中,GZYCT-4和GZYCT-9对K326烟株的根部提取物有明显的趋化作用,分别是其对红花大金元根部提取物趋化反应程度的十八倍和四倍。进一步的碳水化合物趋化试验表明六种碳水化合物对拮抗菌GZYCT-4和GZYCT-9吸引作用不大,明显低于对照组。生物膜成膜试验显示K326烟株的根部提取物比红花大金元的根部提取物更能促进两种拮抗菌生物膜的形成,而六种碳水化合物中,与对照组相比,添加乳糖和甘油促进对拮抗菌GZYCT-4生物膜的形成,其吸光值分别提高了1.3%和0.53%;添加蔗糖和甘油促进对拮抗菌GZYCT-9生物膜的形成,其吸光值分别提高了0.8%和0.54%。平板对峙培养试验表明添加蔗糖的拮抗菌株GZYCT-4和添加木聚糖的拮抗菌株GZYCT-9脂肽粗提取物对烟草青枯病原菌抑菌效果与相应的空白对照组脂肽粗提取物相比,有明显增强,其抑菌圈分别为21.14mm和20.54mm。实时荧光定量分析表明,乳糖和K326根部提取物可提高GZYCT-4中与成膜能力有关的eps D或yqx M、kinC基因的表达;与此同时,蔗糖和K326根部提取物能促进GZYCT-9中与成膜能力有关的epsD、kinC或yqxM基因的表达。5、利用抗生素标记法检测拮抗菌GZYCT-4和GZYCT-9在烟草苗期定殖情况,发现突变菌株GZYCT-4Kan和GZYCT-9Kan可在烟草苗期的根茎叶组织内稳定定殖,两株拮抗菌在烟株中的定殖动态均呈现先上升后下降,随后趋于稳定的状态,两株拮抗菌均可和烟草幼苗形成共生关系。