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空气中微生物以气溶胶(生物气溶胶)形式存在,其组成通常包括细菌、真菌、病毒、过敏原、细菌内毒素、多聚糖、花粉和其它成分,多数直径范围在0.3-100μm。空气微生物的暴露能一系列健康效应如感染性疾病、急性中毒、过敏反应和其它的损害等。因而,发展新技术提高空气微生物的采样和检测效率一直是国内外研究的热点,主要集中在开发高效的采样器与选择适当的样品的检测技术等。其中采样技术是生物气溶胶暴露评价的基础,对空气中微生物采集量的多少直接关系到最终分析得出的结果,采样器的研究是监测技术改进的核心部分。
使用先进检测方法也十分重要,传统的培养方法需要计算可培养微生物的菌落数来评价其在空气中的数量,但是空气中的非可培养微生物数量众多,其对疾病的发生同样起到重要的作用,使用常规培养的方法明显低估了环境中微生物的负荷量。近年来,酶联免疫吸附法(ELISA)、QPCR等新方法在微生物检测中得到了应用,显著提高了检测的灵敏度。研究新的采样和检测方法并将二者有机结合,减少过程中微生物损伤,缩短检测时间、提高检出率,快速检测到空气中微生物数量,是空气微生物定量监测技术的发展方向。
目前空气微生物采样器主要有惯性撞击、过滤阻留、静电沉着三类,每种都有自己的优势,同时也存在不足和缺陷。在以往静电类采样器研究的基础上,本文利用空气中生物气溶胶携带自然电荷的特性,构建了低损伤静电场微生物采样器,并与酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光定量PCR(qPCR)等方法结合,建立了空气中细菌、真菌、过敏原、病毒和军团菌的定量监测新技术。新技术对微生物活性损伤小,采集空气量大,显著提高了采样和检测效率,具有广泛的应用前景。
1.常用空气微生物采样器采样效率的研究
近年来,大流量惯性撞击类采样器被普遍应用到空气微生物暴露监测和评估中,最为常用的是RCSHighFlow采样器(RCS)和便携式安德森采样器-BioStage。在本节中我们结合qPCR技术分析了BioStage和RCS在不同环境中采集到得细菌和真菌的数量,对两种采样器的采集效率和影响因素进行了深入研究。结果表明,在长时间采样情况下,BioStage可以采集到更多的可培养细菌和真菌;短时间采样时,RCS采集到的细菌量多于BioStage。研究证明,由于琼脂表面干燥和微生物颗粒反弹等因素的影响,传统惯性撞击类采样器通过不断增加气体流量的方式提高采样效率,反而会造成实际检出率的下降。
2.低损伤静电场微生物采样器的构建和影响因素的研究
本研究利用气溶胶带自然电荷的特性,研制了一种低损伤静电场微生物采样器(Softelectrostaticsampler),以下简称SES,其采用主动式进气,将气溶胶吸入到采样仓中,然后通过静电场力的作用将带电的生物气溶胶颗粒收集到不同的载体上。与以往的静电类采样器的不同,新采样器仅利用生物气溶胶的自然电荷,不附加空气充电器,减少了采样过程造成的微生物活性损伤,还可以根据不同的分析方法来选择相应的收集载体,如琼脂平皿、吸收液,直接收集气溶胶颗粒。
对电场强度、采样流量、气溶胶颗粒电荷量等影响SES采样效率的因素研究结果表明,过敏原Derp1和Derf1的主要电荷量分布区间分别在0.018-0.026库伦和0.014-0.026库伦之间,根据电荷量分布特点来改进静电场采样器,有助于提高其对空气微生物的采集效率。
3.空气中常见微生物和军团菌静电场定量监测技术的建立与应用
将SES与培养法和qPCR方法结合建立了常见微生物和军团菌静电场定量监测新技术。在研究中使用SES和BioStage对空气中常见的微生物进行平行采样,比较两种采样器对可培养细菌和真菌的采集效率。研究结果表明SES对细菌的采集效率高于安德森采样器,采样率比(R值)最大为2.1;SES对真菌的采集效率也高于安德森采样器,R值最高为4.4。
本研究通过实验室模拟和公共场所现场采样,比较了SES和液体冲击式采样器—Biosampler对嗜肺军团菌的采集效率。研究结果表明,新技术成功的采集和检测到了空气中的嗜肺军团菌,通过增加采样气体总体积可以有效地提高其检测效率,静电场定量监测技术的建立为研究军团菌的分布和传播途径提供了有效手段。
4.空气中病毒、过敏原与毒素静电场定量监测技术的建立和应用
应用SES结合定量PCR(qPCR)方法建立了定量监测流感病毒和过敏原与毒素的新技术。在实验室的模拟仓内与传统的液体冲击式采样器-Biosampler对流感病毒进行平行采样,试验结果表明静电场定量监测技术对高、中、低三种浓度组病毒气溶胶的采集和检测效率均高于Biosampler,其中高浓度组采集效率分别为25.7%和17.9%,中浓度组分别为10.6%和5.7%,低浓度组为7.7%和4.3%,经过配对t检验,三个浓度组差异均有统计学意义(P<0.05),低损伤静电场采样器采集效率是传统的液体撞击采样器的1.5-2倍。
本研究应用SES结合ELISA方法建立了定量监测空气中尘螨过敏原Derp1、Derf1、内毒素和多聚糖的新技术。与Biosampler比较结果表明,SES在四种不同采样条件下采样效率均高于Biosampler。在最佳采样条件下(电压为10KV,流量为5L/min),对尘螨过敏原Derp1的采样率比(R值)为5.1,对尘螨过敏原Derf1的采样率比为5.5,对内毒素的采样率比为9.7,对多聚糖的采样率比为9.1。