研究背景根据我国近年人口普查结果,已有13.5%的人口年龄大于等于65岁,这一数据已经超过世界平均水平,说明我国人口老龄化问题严重。随着年龄的增加,心血管系统对体内外各类损伤愈发敏感,因此心血管疾病的发病率也随着人口老龄化程度的加重而呈逐年上升趋势。其中,缺血性心脏病是最常见的年龄相关心血管疾病之一,也是普通人群中最常见的死亡原因之一。目前缺血性心肌病的基本临床治疗策略是恢复缺血病灶的供血,但是在血管再通过程中不可避免的造成缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤,加剧心肌细胞坏死而造成心功能障碍。阐明衰老相关心肌I/R损伤的发生和调控机制对探索临床治疗新靶点,保护心肌提高临床疗效具有重要意义。SIRT6是Sirtuin蛋白家族成员,依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）发挥去乙酰化酶作用,参与衰老、氧化应激、炎症反应、DNA损伤修复等细胞生物学功能的调控。研究发现,SIRT6对心肌细胞发挥重要的保护作用,在I/R损伤条件下,SIRT6能够通过抗氧化和抗炎作用减轻心肌损伤。有研究证实,组织发生I/R损伤时存在自噬调控紊乱,维持自噬稳态是减轻I/R损伤的重要策略。SIRT6对细胞自噬发挥调控作用,然而,心肌细胞内SIRT6是否能够通过调控自噬发挥I/R损伤保护作用尚不清楚。CHMP2B是ESCRT-Ⅲ复合体的重要亚基之一。该复合体的主要功能是参与蛋白转运及膜剪切。既往研究发现,CHMP2B在心肌细胞中的降解障碍导致自噬功能受损,从而诱导凋亡。课题组前期的相关研究证实,I/R损伤的心肌细胞中CHMP2B表达上调,从而导致自噬通量受损和I/R损伤加剧。然而,衰老小鼠心肌I/R损伤时CHMP2B的表达量调控及自噬功能尚不明确。我们推测:SIRT6可能是调控CHMP2B表达的上游分子,参与自噬功能调控保护心肌减轻I/R损伤。本课题旨在深入研究SIRT6在衰老心肌I/R损伤中的保护作用,阐明其调控自噬的作用机制。研究方法1.构建体内心肌I/R损伤模型和体外心肌细胞缺氧/复氧模型:体内模型采用年轻C57BL/6小鼠（3-4月）与自然衰老C57BL/6小鼠（18-22月）进行心肌左前降支动脉结扎和松解手术（MI/R组）,对照组行假手术（Sham组）;体外模型使用大鼠心肌H9c2细胞系,培养过程中给予缺氧/复氧处理。2.采用经胸超声心动图检查小鼠心脏收缩功能;TTC染色检测心肌缺血梗死面积;乳酸脱氢酶试剂盒检测心肌组织和H9c2细胞损伤程度;TUNEL染色检测心肌组织损伤程度。3.采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测心肌蛋白SIRT6,FoxO1,Atrogin-1,CHMP2B,自噬相关蛋白Atg5,LAMP1,P62,LC3II;免疫组织化学染色法评价心肌中SIRT6,CHMP2B蛋白含量。4.蛋白免疫共沉淀法检测Atrogin-1-CHMP2B的蛋白质相互作用。5.使用自噬LC3荧光双标病毒实时评价细胞自噬流强弱。6.通过染色质免疫共沉淀法以及荧光素酶报告基因评价转录因子FoxO1与目的基因Fbox32（编码Atrogin-1的基因）的相互作用。研究结果1.衰老心肌中CHMP2B蛋白表达量升高,伴随自噬功能异常。对年轻和衰老小鼠心肌组织进行WB和免疫组化检测证实CHMP2B在衰老心肌中表达量升高,同时自噬相关蛋白ATG5、LC3II、p62和LAMP1表达量升高。在年轻和衰老小鼠心肌I/R损伤模型中检测发现,I/R损伤诱导CHMP2B和自噬相关蛋白表达量的进一步升高。2.SIRT6负向调控衰老相关心肌I/R损伤组织中CHMP2B的表达。在人心肌和小鼠心肌样本中,利用WB和免疫组化检测发现,SIRT6的表达量随年龄升高而降低,而CHMP2B表达量升高,二者呈负相关性。在衰老相关心肌I/R损伤小鼠模型中给予SIRT6激动剂MDL800处理,发现SIRT6的激活抑制I/R损伤心肌中CHMP2B和自噬相关蛋白的表达,同时减轻心肌I/R损伤程度。进一步体外研究发现,过表达CHMP2B能够阻断SIRT6激活对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。在心肌特异性敲除SIRT6的小鼠模型中也观察到CHMP2B表达量与SIRT6负相关的现象。以上结果提示:SIRT6负向调控CHMP2B表达。3.SIRT6通过促进Atrogin-1表达介导CHMP2B蛋白的降解。在体外实验中,SIRT6激活剂处理增加Atrogin-1的表达同时降低CHMP2B表达,而使用蛋白酶体抑制剂MG132处理后CHMP2B表达量降低受到抑制,同时阻断了SIRT6激活对缺氧/复氧损伤条件下H9c2细胞的保护作用。Co-IP实验结果显示MDL800处理的H9c2细胞中CHMP2B和Atrogin-1的结合作用增强。干涉Atrogin-1表达后SIRT6激活对CHMP2B的负向调控作用被阻断。4.转录因子FoxO1介导SIRT6对Atrogin-1表达的促进作用。Atrogin-1蛋白编码基因的启动子区存在转录因子FoxO1的结合位点,Ch IP和双荧光素酶报告系统证实FoxO1与Atrogin-1基因启动子区的直接结合作用。H9c2细胞中干涉FoxO1表达后,Atrogin-1表达量降低,而CHMP2B表达量升高。在给予MDL800处理的H9c2细胞同时干涉FoxO1表达,SIRT6激活对Atrogin-1表达的促进作用被阻断,FoxO1干涉组的细胞缺氧/复氧损伤程度加重。5.体内证实SIRT6通过激活FoxO1-Atrogin-1通路降低CHMP2B的胞内含量,维持自噬稳态,减轻心肌I/R损伤。在衰老相关心肌I/R损伤小鼠模型中,MDL800处理的同时给予FoxO1的特异性抑制剂AS1842856,WB检测结果显示:SIRT6的激活促进Atrogin-1的表达而抑制CHMP2B和P62的表达,但是抑制FoxO1活性后SIRT6的这种调控作用被阻断。超声心动图结果显示,MDL800能够改善I/R损伤心脏的功能,而阻断FoxO1后MDL800的心功能改善作用受到抑制。这一结果在TTC染色、血液LDH水平和TUNEL染色实验中也得到证实。研究结论通过以上研究,我们证实衰老相关心肌I/R损伤中激活SIRT6能够通过FoxO1-Atrogin-1通路降低CHMP2B的胞内含量,维持自噬稳态,减轻心肌I/R损伤。阐明了SIRT6在心肌I/R损伤中对CHMP2B和自噬的调控作用及机制,为衰老相关心肌I/R损伤的治疗和预防提供新的治疗靶点。