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目的：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylocouccus aureus,MRSA)是全球医院感染的重要革兰阳性细菌,具有高发病率、高致死率、治疗棘手的特点。自发现以来分离率逐年增加,流行范围不断扩大,而抗生素的滥用导致了MRSA多药耐药现象日益严重,对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、氟喹喏酮类和磺胺类等多种抗生素均能产生不同程度的耐药。糖肽类抗生素万古霉素是治疗MRSA感染的“最后防线”,但已出现中介耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin-intermediary staphylococcus aureus,VISA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin-resistant staphylococcus aureus,VRSA).近年来上市的利奈唑胺和达托霉素等抗MRSA药物也相继发现耐药菌,因此寻找有效的抗MRSA新药已经迫在眉睫。MRSA的耐药机制主要包括以下几个方面：①大量表达由mecA基因编码产生的特殊耐药蛋白—青霉素结合蛋白2a(PBP2a),能够补充或代偿被抗菌药物抑制的PBP2的转肽酶功能,从而继续维持细菌细胞壁合成；②产生p-内酰胺酶,促进p-内酰胺酶类抗生素的水解；③减少药物积聚,主要与存在于金黄色葡球菌细胞膜上的外排泵蛋白相关。研发新型抗生素是目前人类对抗细菌最有效的途径之一,针对MRSA的不断扩散,人们通过生物提取、化学合成或对已有抗生素进行结构修饰等方式获取具有更强抗菌活性的药物。中药长期应用于感染性疾病的治疗,我国的中草药资源为天然抗MRSA药物的开发提供了丰富来源。本课题组前期以抗菌活性为导向,以MRSA标准菌株作为研究对象,对30种清热解毒中药进行了筛选,发现虎杖粗提物具有一定的抗MRSA活性。因此,本研究在前期研究工作基础上,首先对虎杖中具有直接抗MRSA作用的活性物质进行定向分离,然后对该活性物质进行体内、外生物学活性研究,最后对其抗MRSA作用机制进行研究。方法：1.将天然药物分离方法与生物学活性研究相结合,从虎杖中定向分离具有抗MRSA活性的组分和单体化合物1.1通过80%乙醇粗提、有机试剂萃取获得萃取部位,MIC法观察各部位活性；1.2柱层析分离活性部位,观察各组分抗菌活性；1.3纯化活性组分,获得单体以质谱、核磁共振鉴定结构。2.大黄素抗MRSA体外作用研究2.1以MRSA252标准株及36株MRSA临床分离株为研究对象,通过MIC、MBC测定观察大黄素抗MRSA活性；2.2杀菌曲线观察大黄素的动态杀菌作用；2.3多代耐药诱导法观察大黄素是否容易诱导MRSA产生耐药。3.大黄素抗MRSA体内作用3.1建立MRSA攻击小鼠致死与亚致死模型；3.2大黄素对致死剂量MRSA攻击小鼠的生存保护作用；3.3大黄素对亚致死剂量MRSA攻击小鼠血液中细菌数量的影响。4.大黄素对哺乳动物细胞的细胞毒性及红细胞膜稳定性的影响4.1通过MTT法测定大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7活力的影响；4.2采用溶血实验观察大黄素对兔血红细胞膜稳定性的影响。5.大黄素抗MRSA作用机制研究5.1大黄素对MRSA主要耐药机制的影响5.1.1利用生物传感器技术观察大黄素与PBP2a的亲和力；RT-PCR方法观察大黄素对mecA基因表达的影响；5.1.2 Nitrocefin法观察大黄素对MRSA252标准株p-内酰胺酶的影响；5.1.3荧光分光光度法观察大黄素对柔红霉素在MRSA252内聚集的影响。5.2大黄素对MRSA细胞壁合成、水解相关基因表达的影响5.2.1采用扫描电镜与透射电镜技术观察大黄素对MRSA252形态的影响；5.2.2采用RT-PCR 方法观察大黄素对MRSA细胞壁合成、水解相关基因表达的影响。5.3大黄素对MRSA细胞膜的作用5.3.1通过检测荧光偏振度的变化观察大黄素对MRSA252细胞膜流动性的影响；5.3.2应用核酸探针观察大黄素对MRSA252细胞膜完整性的影响。结果：1.从虎杖乙酸乙酯萃取部位分离纯化获得具有直接抗MRSA作用的单体化合物,经结构鉴定确定其为蒽醌类化合物大黄素；2.大黄素对MRSA252标准株与36株MRSA临床分离株MIC为2-8 μg/mL、MBC为4-32 μg/mL, MBC/MIC值为1-2；大黄素不易诱导MRSA产生耐药性；3.大黄素对MRSA攻击小鼠具有显著保护作用,低、中、高剂量大黄素对小鼠的保护率分别为12.5%、50%、87.5%；大黄素可以显著降低MRSA感染小鼠血液中细菌数量,且具有明显的量效关系；4.大黄素(<32 μg/mL)对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞活力无显著影响；大黄素(<64 μg/mL)对兔血红细胞膜稳定性无显著影响；5.大黄素抗MRSA作用机制研究5.1大黄素与PBP2a亲和力较低,对mecA基因表达无显著影响；大黄素不能抑制MRSA252菌p-内酰胺酶的活性；大黄素不能增加柔红霉素在菌体内的积聚；5.2大黄素能破坏MRSA252细胞壁与细胞膜结构；大黄素对MRSA细胞壁合成、水解相关基因表达无显著影响；5.3大黄素能够降低MRSA252菌细胞膜流动性、破坏细胞膜的完整性。结论：1.大黄素具有显著的体内、外抗MRSA作用,且不易诱导]MRSA产生耐药性；2.作用机制研究表明,大黄素抗MRSA作用与其降低细胞膜流动性、破坏细胞膜完整性有关,而与其影响细胞壁合成与水解相关基因表达、PBP2a、β-内酰胺酶和药物积聚无关。3.将大黄素作为先导化合物进行深入研究有助于发现药物新靶点和治疗MRSA感染的新药。