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LOXL2(lysyl oxidase like 2)是LOX(赖氨酰氧化酶)家族中备受关注的一员,已有文献证明在细胞外基质(ECM)中LOXL2具有同LOX类似的功能作用,都能促进胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联。除此之外,LOXL2还参与转录调节、细胞信号传导和细胞黏附调节。据报道,LOXL2在多种类型的肿瘤中均高表达,并具有促进各种肿瘤细胞增殖和迁移的能力。然而,迄今为止,LOXL2表达的调节机制在很大程度上仍是未知的。为了深入研究并揭示LOXL2的转录调控机制,在本论文中我们成功克隆了LOXL2启动子区域并对其作出了详细鉴定。1、LOXL2基因结构和染色质状态分析LOXL2基因结构和染色质状态分析结果显示LOXL2基因位于染色体8p21,由14个外显子和13个内含子组成,其第一个外显子附近包括一个活性启动子(数据来自UCSC基因组数据库)。2、LOXL2基因启动子重组体构建采用无缝克隆方法分别构建了五个不同的LOXL2基因启动子荧光素酶报告基因重组体,覆盖了LOXL2基因转录起始位点上游1.7 kb,并通过DNA测序确认。根据其长度命名为:P1773(-1651/+122),P1207(-1085/+122),P636(-514/+122),P401(-279/+122),P185(-63/+122)。3、LOXL2基因启动子重组体活性测定在293T细胞和HCT116细胞中分别进行了一系列的荧光素酶报告基因实验,结果显示所有五个重组体均表现出显著的启动子活性,并且确定LOXL2核心启动子位于转录起始位点附近185 bp的区域。分析转录因子结合位点后发现:LOXL2启动子缺乏经典的TATA框,但包含经典转录因子如Sp1和NF-κB的预测结合位点。这些结果提示Sp1可能对LOXL2有调控作用。4、Sp1对LOXL2基因的表达调控作用在293T细胞和HCT116细胞中分别瞬时共转染Sp1过表达质粒和LOXL2基因启动子重组体质粒,经Dual-Luciferase?Reporter Assay、定量RT-PCR、Western Blot实验检测,结果表明Sp1的异位过表达显著增强了各个LOXL2基因启动子重组体的活性及其在两类细胞中的内源性表达。相反,用光神霉素A(选择性Sp1抑制剂)治疗后会明显抑制各个LOXL2启动子重组体活性及其内源性转录。定点突变实验进一步证实Sp1结合位点对于LOXL2基因的近端启动子活性是必不可少的。染色质免疫沉淀(ChIP)分析表明细胞内Sp1同LOXL2启动子相结合。5、结直肠癌中Sp1和LOXL2表达的临床意义最后,为了进一步了解LOXL2和Sp1是否与结直肠癌的临床意义相关,我们对它们的表达水平和临床结果进行了联合分析。结果显示Sp1和LOXL2的表达呈正相关,而且LOXL2的高表达与结直肠癌的不良预后也有密切联系,强烈暗示了Sp1介导的LOXL2反式激活在结直肠癌发病中的意义。综上所述,在本次研究中,我们对LOXL2基因的启动子区域作出了预测,并提供了确实的实验数据支持研究结论。同时,我们还进行了深入研究,通过多项实验来论证重要转录因子Sp1可以直接调节LOXL2的转录活性,这既为进一步揭示LOXL2基因的表达和调控机制打下了坚实的基础,还有助于更深入地分析LOXL2在细胞增殖和癌变中的生物学功能。