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目的:为探索白血病发生发展、增殖及凋亡与HOXA5基因的关系,本文首先观察儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)患儿骨髓(homeobox,HOX)A5的表达情况。在此基础上,设计合成针对HOXA5基因表达的小干扰RNA(small interference,siRNA)序列,并测定其siRNA的功能,从而构建针对HOXA5shRNA真核表达载体pRNAT-GFP-Neo-HOXA5,转染人急性T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat),观察其对Jurkat细胞周期及凋亡的影响,为进一步探讨白血病的发生机制及靶向治疗提供理论依据。方法:1.病例及分组:ALL急性期:ALL初发25例;ALL缓解期:25例ALL经诱导缓解治疗达完全缓解(ALL-CR)组;对照组:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)患儿,共20例。在征得患儿家属同意的前提下对样本进行采集。采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞。2.实时荧光定量PCR(FQ-PCR)和蛋白质印记法(Western blot)测定ALL急性期、ALL缓解期及对照组(ITP)三组骨髓单个核细胞HOXA5m RNA和蛋白相对表达量。3.根据HOXA5基因的m RNA序列,设计合成三条针对HOXA5基因不同位点的si RNA序列,并筛选有效干扰HOXA5基因表达的特异性si RNA序列,构建靶向HOXA5的sh RNA真核表达载体pRNAT-GFP-Neo-si HOXA5。4.实验分组:取对数期细胞(约3x107/ml),将Jurkat细胞分为三组:实验组(脂质体转染靶向hoxa5的sirna)、阴性对照组(脂质体转染阴性对照sirna)和空白对照组(仅加等量细胞及培养基)。5.转染后fq-pcr:通过脂质体lipofectaminetm2000介导sirna转染jurkat细胞,48h后通过fq-pcr和westernblot测定实验组、阴性对照组和空白对照组三组jurkat细胞hoxa5mrna和蛋白相对表达水平。6.流式细胞分析仪检测:测定特异性sirna抑制hoxa5基因表达后,实验组、阴性对照组和空白对照组三组jurkat细胞周期分布和凋亡率的变化。结果:1hoxa5mrna表达量all急性期(0.76±0.05)%显著高于all缓解期(0.48±0.07)%和对照组(0.47±0.08)%(p<0.05)。all急性期(0.70±0.02)hoxa5蛋白表达量显著高于all缓解期(0.39±0.03)和(itp)对照组(0.42±0.02)(p<0.05)。2设计并构建针对hoxa5基因的段发卡rna(shorthairpin,shrna),与阴性对照组和空白对照组相比,实验组hoxa5基因的表达量明显下降,转染后实验组各组jurkat细胞基因表达受抑制,通过fq-pcr和westernblot检测出基因沉默效果最好的1条质粒,其中序列prnat-gfp-neo-hoxa5c的效果最为显著。3成功构建了有效沉默hoxa5基因的质粒表达载体;与阴性对照组(0.73±0.003)及空白对照组(0.73±0.01)相比,实验组(prnat-gfp-neo-hoxa5c)hoxa5mrna表达水平(0.17±0.01)较明显下降(p<0.05)。与阴性对照组(1.34±0.06)%和空白对照组(1.29±0.21)%相比,实验组(prnat-gfp-neo-hoxa5c)jurkat细胞hoxa5蛋白表达水平(0.39±0.01)%明显下降(p<0.05)。4prnat-gfp-neo-sihoxa5c重组载体转染jurkat细胞,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组jurkat细胞G0/Gl期细胞比例明显增加(38.69%±2.2%和38.55%±6.0%VS56.70%±6.4%),S期细胞比例相应下降(48.86%±6.0%和49.53%±8.3%VS 29.00%±5.5%)(P<0.05)。实验组细胞凋亡率为(24.99±5.16)%,显著高于阴性对照组(13.94±O.98)%和空白对照组(13.98±1.05)%(P<0.05)。结论:1、ALL急性期患儿骨髓中HOXA5mRNA和蛋白呈高表达,提示HOXA5的高表达与ALL的发生有关;2、成功构建的针对HOXA5基因的siRNA表达载体,能够有效沉默HOXA5基因的表达,Jurkat细胞的增殖能力显著降低,促使静止在GO/G1期的细胞数目增多,并诱导其凋亡。3、本研究为急性淋巴细胞白血病靶向治疗提供了新的理论依据。