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尿苷作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值,已广泛应用于医药行业。微生物发酵法生产尿苷具有条件温和,操作简单,易操作等优点,是工业化生产尿苷的理想方法,高产尿苷的优良菌种构建是发酵法生产的前提条件。本研究采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术对野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110进行系统的代谢工程改造,构建尿苷高产菌株。首先,将Bacillus subtilis A260的嘧啶核苷操纵子基因整合至E.coli W3110基因组上,构建了菌株UR1。摇瓶发酵结果显示,菌株UR1的发酵液中尿苷的浓度呈现先升高后下降的趋势,然而副产物尿嘧啶在整个发酵周期不断积累;发酵32 h,尿苷产量为3g/L,尿嘧啶产量为4.5g/L。其次,为了减少副产物尿嘧啶的积累,阻断了尿苷的降解,敲除与尿苷分解代谢相关的基因(udp,udk,rihA/B/C),构建菌UR2-5。摇瓶发酵结果显示,尿苷产量为7.8 g/L,与菌株UR1相比提高了 136%,但副产物尿嘧啶仍有少量积累,产量为0.6 g/L。最后,为了进一步增加尿苷的积累量,对尿苷合成的前体物质氨甲酰磷酸,天冬氨酸和PRPP的合成和代谢相关途径进行改造。(1)以UR2-5菌株为出发菌株,过表达氨甲酰磷酸合成酶得到菌株UR3。摇瓶发酵结果显示,菌株UR3的尿苷产量为9.3 g/L,同UR2-5相比提高了 19.23%。(2)在UR3菌株的基础上,敲除thrA基因得到菌株UR4。摇瓶发酵结果显示,菌株UR4的尿苷产量为12.2g/L,同UR3相比提高了 31.18%。(3)在UR4菌株的基础上,过表达prsA基因得到菌株UR5。摇瓶发酵结果显示,菌株UR5的尿苷产量为13.8 g/L,相比UR4提高了 13.11%,糖苷转化率提高47.16%。该菌株5 L发酵罐培养64 h,可积累尿苷70 g/L,糖苷转化率为22.3%,最大生产强度为1.5 g/L/h,是目前报道的发酵法生产尿苷的最高水平,为尿苷发酵生产的产业化奠定了坚实基础。