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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节损伤和滑膜炎症为特征的慢性自身免疫病,尚不清楚其发病机制。导致其发病的原因可能是由于非免疫细胞成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)和免疫细胞如腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,p M)、树突状细胞(dendritic cells,DC)、T细胞、B细胞等细胞的过度活化。色氨酸(L-tryptophan,Trp)代谢通路在免疫系统中有很重要的作用,Trp是人体必需的氨基酸,是许多信号分子形成的前体,可以调节适应性免疫反应。绝大部分的Trp是通过犬尿氨酸(L-kynurenine,Kyn)途径代谢,此途径生成Kyn及下游产物,参与炎症和免疫反应。在正常机体中,Trp和Kyn维持着一个动态平衡,但当体内的Trp和Kyn含量发生变化时,RA等自身免疫病、肾脏疾病、病毒感染或恶性肿瘤等疾病就会被诱发。由于Kyn代谢与炎症反应之间存在着密切的关系,Kyn已成为RA等多种疾病的公认参与者。吲哚胺2,3双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)、吲哚胺2,3双加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase 2,IDO2)和色氨酸2,3双加氧酶(tryptophan 2,3 dioxygenase,TDO2)是催化此代谢通路导致Trp和Kyn含量变化的第一限速酶,研究表明RA患者血清中Trp浓度降低,Kyn浓度升高,胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠肝脏和血清中Trp浓度降低,Kyn浓度升高。IDO1在免疫系统中的作用已经比较明确,在正常机体中在p M和DC等细胞中表达较低,具有较低的底物选择性,在发病机体中如RA中可被γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素1(interleukin-1,IL-1)等炎性因子显著上调高表达,研究表明IDO1主要影响免疫应答初始阶段。TDO2在生理条件下主要表达在哺乳动物肝脏中,底物选择性较高。新近研究发现,TDO2在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,能够促进Th1和Th17的分化,提示TDO2可能介导机体免疫反应,但TDO2在自身免疫病中的作用未见报道。本课题通过建立大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)模型,通过体内外实验研究TDO2在AA大鼠不同组织和细胞中的表达,初步探讨其作用机制。目的:检测TDO2在AA大鼠不同组织和细胞中的表达;研究TDO2抑制剂对不同细胞功能的影响,阐明TDO2介导的犬尿氨酸通路参与大鼠AA病程发生发展的作用;以TDO2为研究靶点,为发现新的病理机制和新的药物靶点治疗RA提供理论依据和实验依据。方法:通过建立大鼠AA模型,在不同炎症阶段(炎症初期、炎症高峰期和炎症缓解期)取AA大鼠血清和肝脏组织,采用HPLC法检测血清和肝脏中Trp和Kyn的浓度变化;采用免疫组化法检测正常和AA大鼠不同炎症阶段关节滑膜组织和肝脏组织中IDO1和TDO2的表达,观察IDO1和TDO2在AA大鼠不同炎症阶段的表达变化;分离和培养正常和AA大鼠的FLS、p M、T、B细胞,采用western blot法和激光共聚焦法检测TDO2在免疫细胞和非免疫细胞中的表达变化;采用CCK-8法检测Kyn和TDO2抑制剂对FLS及转染TDO2 si RNA的FLS增殖能力的影响,采用Transwell法检测Kyn和TDO2抑制剂680C91对FLS及转染TDO2 si RNA的FLS迁移和侵袭能力的影响;通过western blot法检测680C91对p M细胞中i NOS和Arg1的影响,观察690C91对p M中M1和M2极化的影响;采用CCK-8法检测Kyn和680C91对T、B淋巴细胞增殖的影响。结果:1.AA大鼠不同炎症阶段血清和肝脏中Trp、Kyn含量及Kyn/Trp比值的变化和正常组相比,AA大鼠血清和肝脏中不同炎症阶段Trp浓度均降低,Kyn浓度均升高,Kyn/Trp比值升高。血清中AA大鼠初期Kyn/Trp比值升高较明显,肝脏组织中Kyn/Trp比值在AA大鼠高峰期显著升高。2.IDO1和TDO2在AA大鼠不同炎症阶段关节滑膜组织和肝脏组织中的表达与正常组大鼠相比,IDO1的表达在AA大鼠不同炎症阶段滑膜组织中均升高,在初期阶段表达最高;AA大鼠不同炎症阶段关节滑膜组织和肝脏组织中TDO2表达均升高,在AA大鼠高峰期表达升高最为明显。3.TDO2在FLS、p M、T、B淋巴细胞中的表达变化Western blot法显示,与正常组相比,FLS、p M、T、B淋巴细胞中TDO2表达明显升高。激光共聚焦法结果显示,在FLS中,TDO2主要表达在细胞胞浆;在p M中,TDO2主要表达在细胞的胞浆和胞核中,与western blot法结果一致。4.Kyn和TDO2抑制剂680C91对T、B淋巴细胞增殖的影响和对照组相比,Kyn(50μM,100μM,200μM)对正常和AA大鼠T、B淋巴细胞的增殖也有促进作用。680C91(2.5μM,5.0μM,10.0μM)体外给药呈浓度依赖性的抑制T、B淋巴细胞的增殖。5.TDO2抑制剂680C91对AA大鼠p M极化的影响680C91可以降低i NOS的表达水平,升高Arg1的表达水平,提示690C91可以抑制M1的极化,促进M2的极化。6.Kyn和TDO2抑制剂680C91对AA大鼠FLS功能的影响和对照组相比,Kyn(50μM,100μM,200μM)对正常和AA大鼠FLS的增殖反应、迁移和侵袭能力均有显著促进作用。680C91(2.5μM,5.0μM,10.0μM)体外给药可以抑制AA大鼠FLS异常的增殖、迁移和侵袭能力。7.转染TDO2 si RNA对AA大鼠FLS功能的影响与对照组相比,TDO2基因干扰的FLS增殖、迁移和侵袭功能降低,体外加入Kyn后,FLS的功能和活化能力又恢复。结论:1.TDO2在AA大鼠炎症高峰期表达及酶活性增高,IDO1在AA大鼠炎症初期阶段的表达及酶活性增高,提示TDO2和IDO1介导的Kyn代谢参与AA大鼠的炎症反应。TDO2主要参与AA大鼠炎症高峰期炎症反应;IDO1主要参与AA大鼠的炎症初期炎症反应。2.TDO2在AA大鼠FLS和免疫细胞p M、T、B细胞中表达显著升高,提示TDO2在各个细胞中的高表达可能参与了AA发生发展。3.Kyn促进正常和AA大鼠FLS的增殖、迁移和侵袭能力,增强T、B淋巴细胞的增殖,提示TDO2介导的Kyn可能参与了AA大鼠的免疫反应和滑膜炎症。4.TDO2抑制剂可以抑制AA大鼠FLS的的增殖、迁移和侵袭能力,降低T、B淋巴细胞的增殖能力,且可以抑制p M中M1的极化,促进M2的极化,提示降低TDO2的表达或者活性可以减缓炎症的发生和发展。5.TDO2在RA的发生发展中具有重要作用,通过抑制TDO2的表达和酶活性有望成为治疗RA等自身免疫病的新靶点和新策略。