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肿瘤的过继免疫治疗(Adoptive immunotherapy,AIT)一直是肿瘤生物治疗研究中最为活跃的一个领域,输入自体来源的抗原特异性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)不仅可特异、有效杀死靶细胞,还可克服因体内免疫细胞的“无能”状态导致疫苗治疗效果的低下问题。所以体外充分有效的活化CTL细胞,使其被回输入体内后能繁殖生存而不凋亡,可趋化到肿瘤所在部位,特异性识别并杀死靶细胞,而对正常细胞没有毒性,成了人们选择合适过继免疫治疗方法的参考指标。人工抗原递呈细胞(artificial antigen presentation cell,aAPC)体外活化CTL细胞时具有简化操作流程、重复性好、成本低的优点,而且近年来不断完善,产生令人鼓舞的应用前景。本课题首先构建pV4-1BBL-CD86和pcDNA3.1(+)-CD32a两个真核表达载体,并先后转染K562细胞,经过筛选得到稳定表达4-1BBL、CD86和CD32a的细胞系命名为K32/4-1BBL/CD86。然后将K32/4-1BBL/CD86细胞和CD3单抗孵育后作用人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),分别观察其刺激CD4+T和CD8+T细胞的活化、CD3+T细胞的增殖与分裂、PBMC的抗凋亡能力、以及CTL细胞分泌细胞因子IFN-γ和穿孔素的能力。最后利用移植肿瘤动物模型,将此人工APC(K32/4-1BBL/CD86)体外刺激活化的PBMC输入瘤组织内,观察其抑制肿瘤生长的效应。一、人工抗原递呈细胞K32/4-1BBL/CD86的制备淋巴细胞的活化需要抗原递呈细胞提供双信号,由MHC I类分子递呈抗原肽供TCR/CD3复合体识别提供第一信号,由APC表面的共刺激分子如CD86、4-1BBL、ICOSL等提供第二信号。本课题首先将4-1BBL和CD86的cDNA插入具有两个多克隆位点的真核表达载体pVITRO2-mcs,构建pV4-1BBL-CD86双表达载体。通过脂质体转染HLA I类分子缺陷表达的细胞株K562,利用潮霉素稳定筛选4-1BBL和CD86共表达的细胞,经流式细胞仪鉴定并进一步分选,将其命名为K562/4-1BBL/CD86。然后自人单核细胞株U937细胞克隆IgGFc段的低亲合力受体CD32a,插入真核表达载体pCDNA3.1(+),转染K562/4-1BBL/CD86细胞,利用G418和潮霉素稳定筛选CD32a、4-1BBL和CD86均表达的K562细胞,流式细胞仪鉴定并进一步分选,命名为K32/4-1BBL/CD86。K32/4-1BBL/CD86细胞可通过细胞表面的CD32a分子与CD3单克隆抗体的Fc段结合,CD3单抗特异性结合T细胞表面的CD3受体,向T细胞传递第一信号,由4-1BBL/CD86分子向T细胞提供共刺激信号,进而活化CD3+T细胞。二、体外分析K32/4-1BBL/CD86细胞活化人PBMC的能力分离正常人外周血单个核细胞,同时取培养对数期的K32/4-1BBL/CD86细胞用丝裂霉素C处理。将两种细胞按不同比例混合培养,分别观察K32/4-1BBL/CD86细胞对CD4+T细胞、和CD8+T细胞活化、CD3+T细胞增殖和分裂、PBMC抗凋亡能力、细胞毒活性以及CTL细胞分泌IFN-γ和穿孔素的影响能力。结果发现人PBMC经K32/4-1BBL/CD86细胞刺激后,CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达显著上调(P﹤0.001);CD3+T细胞的增殖能力明显增强,与对照组相比,刺激5天后增殖能力提高2倍,刺激8天与刺激5天相比无明显变化;CD3+T细胞的分裂速度明显加快;活化PBMC的抗凋亡能力明显提高,与对照细胞相比提高6.57倍;活化T细胞分泌IFN-γ、穿孔素的能力明显增强,与对照细胞相比,分别提高9.14倍和3.8倍(P﹤0.05)。三、体内观察K32/4-1BBL/CD86细胞活化的PBMC对肿瘤生长的抑制作用取对数期生长的人结肠癌细胞株LS-174-T(HLA-A2阳性),以3×106个细胞/鼠的细胞密度接种NOD-SCID小鼠腋窝后侧皮下,4天后肉眼可见米粒大小肿瘤。K32/4-1BBL/CD86细胞经同位素照射(100Gy),并与CD3单抗孵育后,体外刺激HLA-A2阳性正常人的PBMC细胞。于种植肿瘤细胞后第5天瘤内注射体外活化的PBMC,每周一次,共三次,注射活化PBMC细胞总数达3×107个/鼠。每天观察小鼠的一般状况,每3天测量移植瘤体积变化。结果显示经活化PBMC治疗的实验小鼠组的肿瘤生长速度明显慢于无aAPC刺激活化PBMC治疗组及PBS对照组(P﹤0.05)。