论文部分内容阅读
食管癌发生发展过程中存在大量分子异常改变。实验室前期工作中获得一个食管癌组织高表达蛋白Calreticulin(CRT),功能研究发现CRT可促进食管癌细胞侵袭迁移,表达谱芯片分析显示包括Neuropilin-1(NRP1)在内的多个基因在食管癌细胞中受CRT调控。本工作进一步研究了NRP1介导CRT影响食管癌细胞恶性表型的分子机制。Real-time PCR与Western blot验证结果表明CRT可以促进NRP1mRNA口蛋白表达。体外细胞侵袭与迁移实验显示,敲降NRP1食管癌细胞侵袭迁移能力明显降低；敲降CRT回复NRP1表达,食管癌细胞侵袭迁移能力得到回复。裸鼠肺转移实验显示,抑制NRP1表达,食管癌细胞肺转移结节数量显著降低。敲降CRT或NRP1均能抑制MMP2、MMP9及FAK的表达,提示CRT-NRP1通路异常可能是食管癌细胞侵袭迁移的重要机制。染色质免疫沉淀(ChIP)与双荧光素酶报告基因实验结果显示,转录因子STAT5A能够调控NRP1的转录。检测发现CRT增强STAT5A的转录活性。在食管癌组织中验证发现,CRT与NRP1表达显著正相关。这些结果说明,我们发现了一个新的促进食管癌细胞侵袭迁移信号通路,即CRT-STAT5A-NRP1。食管癌组织分析显示,NRP1高表达与原发性肿瘤浸润深度和患者不良预后显著正相关。细胞表型研究结果显示,NRP1可以增强食管癌细胞增殖及裸鼠成瘤能力。进一步研究发现,NRP1可以上调N F-κB P65亚基的mRNA和蛋白表达,回复实验结果提示NRP1可调控P65表达进而影响食管癌细胞的增殖。由于NRP1不具备转录因子功能,我们进一步研究了介导NRP1促进P65转录的机制。通过生物信息学分析、ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验获得了P65的候选转录因子cAMP反应元件结合蛋白CREB。我们发现NRP1可与表皮生长因子受体EGFR相互作用并激活EGFR,NRP1的b1/b2结构域对EGFR的活化起到关键作用；EGFR通过AKT通路调控CREB的转录因子活性,进而影响P65表达。在食管癌组织中利用连续切片检测发现,NRP1与P65表达水平显著正相关。由此我们揭示了NRP1调控食管癌增殖的信号通路,即NRP1-EGFR-AKT-CREB-P65。利用NRP1靶向多肽处理肿瘤细胞,结果显示多肽终浓度为5μmol/L时,大多数NRP1高表达的肿瘤细胞系生长显著受到抑制；按照250μg/只的剂量,每周腹腔注射给药2次,能够明显抑制食管癌细胞裸鼠皮下瘤的生长,提示NRP1可能作为潜在的肿瘤治疗靶点。