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研究背景：
原发性肝癌是世界上最常见的实体肿瘤之一，其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌最常见的病理类型，约占肝癌的75-80％。HCC具有高浸润性和转移潜能，容易转移和复发，五年生存率较低，是目前肝脏相关疾病死亡的主要原因。因此，为了提高肝癌患者的生存率和改善生活质量，探索新型的肝癌早期生物标志物及寻求有效的药物治疗靶点，是当前肝癌研究工作的重点和热点。SPATS2(Spermatogenesis associated serine rich 2)，又名SCR59、p59SCR、SPATA10、Nbla00526。编码该蛋白的基因位于12号染色体上，定位于12q13.12，含有16个外显子，可编码545个氨基酸的多肽。进一步研究发现SPATS2可在25个人体组织中表达。随后的研究表明，SPATS2参与了lncRNASNHG5介导的结直肠癌细胞生长过程。另外，也有研究发现SPATS2与前列腺癌进展有关。然而，SPATS2在肝癌中的表达以及功能尚缺乏全面的研究。
本研究利用生物信息学、分子生物学、RIP等实验手段，结合癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、GEO等公共数据库肝癌表达谱数据集以及具有河南地区遗传背景的肝癌病理组织微矩阵芯片分析了SPATS2在肝癌中的表达及其临床意义；利用体内、外功能实验研究了SPATS2对肝癌增殖、迁移、侵袭及克隆形成等恶性生物学行为的影响；并进一步应用生物信息分析预测及体外实验筛选及验证出能够靶向调控SPATS2的miR-145-5p，并利用功能回补实验系统地研究了miR-145-5p/SPATS2信号轴在肝癌进展中的功能。
我们得出以下结论：SPATS2在HCC组织和肝癌细胞系中上调；SPATS2能够通过调节细胞周期和细胞凋亡促进HCC恶性表型；此外，SPATS2是抑癌基因miR-145-5p的下游靶基因，miR-145-5p可通过负调控SPATS2的表达发挥其肿瘤抑制功能。综上所述，本研究探索了miR-145-5p/SPATS2轴在肝癌的发生和发展中的功能及分子机制，miR-145-5p/SPATS2轴具有作为肝癌预后判断标志物及治疗靶点的可能性。
第一部分SPATS2在肝癌组织中的表达及其与患者临床预后的相关分析
目的：
研究SPATS2在肝癌组织中的表达及其和临床特征及预后的关系
方法：
1.免疫印迹法(Western blot)方法检测SPATS2蛋白在肝癌组织中的表达；
2.免疫组化方法检测SPATS2蛋白在肝癌组织中的表达水平；
3.分析TCGA数据库和GEO数据库中SPATS2mRNA在肝癌组织中的表达水平；
4.在郑州大学(ZZU)肝癌组织芯片队列中探索SPATS2蛋白表达水平与肝癌临床表型、生存预后的相关性，并应用TCGA数据库和GEO数据库进一步分析SPATS2mRNA表达水平和肝癌患者临床特征及预后的关系。
结果：
1.与癌旁组织相比，肝癌组织中SPATS2在mRNA和蛋白水平均呈现高表达；
2.生存分析提示SPATS2高表达的肝癌患者生存期显著短于SPATS2低表达的肝癌患者；
3.COX回归分析证实SPATS2高表达是肝癌患者死亡的独立危险因素，提示SPATS2是潜在的预后标志物。
第二部分SPATS2对肝癌细胞的生物学行为的影响
目的：
研究SPATS2在肝癌细胞系中的表达及其对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及克隆形成等恶性生物学行为的影响
方法：
1.利用Westernblot和免疫荧光检测SPATS2在肝癌细胞系中的表达及定位；
2.利用慢病毒转染技术在肝癌细胞系进行SPATS2沉默，分析SPATS2对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及克隆形成能力的影响；
3.分析SPATS2沉默对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响。
4.生信分析结合体外试验探索SPATS2调控肝癌细胞恶性表型的潜在分子机制；
结果：
1.SPATS2在肝癌细胞中表达较正常肝细胞明显升高；细胞免疫荧光证实SPATS2主要定位于细胞胞浆内；
2.与对照组相比，在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中沉默SPATS2的表达后，细胞增殖、DNA合成和克隆形成能力显著降低；同时细胞的侵袭和迁移能力也受到显著抑制，并且敲减SPATS2可显著抑制迁移相关蛋白(如CXCR4，MMP-2，MMP-7和MMP-9)的表达；
3.与对照组相比，在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中沉默SPATS2的表达后，细胞凋亡水平明显增加；
4.SPATS2基因沉默后，细胞周期相关p21和p27表达水平明显增加，肝癌细胞出现细胞周期停滞。同时出现抗凋亡蛋白Survivin和C-myc水平减低，Bax、Bak、Cleaved-caspase3和CytochromeC促凋亡蛋白显著升高。这些结果表明细胞周期相关通路是SPATS2参与肝癌进展的下游信号通路。
第三部分SPATS2对肝癌增殖和转移能力影响的动物体内研究
目的：
应用动物模型探索体内SPATS2对肝癌增殖和转移能力影响
方法：
1.应用慢病毒转染技术构建SPATS2稳定沉默的人源SMMC-7721细胞系，并建立裸鼠皮下肝癌荷瘤模型，探索SPATS2对裸鼠皮下种植瘤增殖的影响
结果：
1.与对照组相比，降低SPATS2蛋白表达后荷瘤模型的肿瘤增殖速度明显减慢，肿瘤体积减小。
2.和对照组的裸鼠相比，沉默SPATS2基因后，细胞增殖标志物Ki-67的表达降低，肝癌细胞增殖速度减慢，SPATS2蛋白可抑制肝癌细胞的体内增殖能力。
第四部分靶向SPATS2基因的miR-145-5p的筛选与鉴定及其对肝癌细胞生物学行为的影响
目的：
筛选并鉴定参与调节SPATS2表达的miRNA分子，探索SPATS2异常表达的上游分子调控机制
方法：
1.利用生物信息预测方法和双荧光素酶报告实验预测并验证能够靶向结合SPATS2的miR-145-5p；
2.实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和Westernblot进一步验证miR-145-5p靶向调节SPATS2表达作用；免疫共沉淀和相关性分析研究miR-145-5p和SPATS2的相互结合及表达相关性；
3.回补实验研究SPATS2是否介导了miR-145-5p对肝癌细胞恶性表型的抑制作用；
4.回补实验探索SPATS2是否介导了miR-145-5p对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响。
结果：
1.生物信息学分析和细胞实验证实miR-145-5p能够靶向结合至SPATS2的3’-UTR；
2.Pearson相关性分析发现miR-145-5p和SPATS2在肝癌中的表达呈显著负相关；
3.体外实验在mRNA水平和蛋白质水平均证实miR-145-5p能够抑制SPATS2的表达；
4.功能回补实验证实在肝癌细胞中过表达miR-145-5p后，肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力明显下降，而过表达SPATS2能够部分逆转miR-145-5p过表达导致的肿瘤抑制作用；
5.回补实验证实miR-145-5p/SPATS2调节轴对肝癌细胞凋亡和细胞周期相关蛋白有显著影响。
全文结论
1.SPATS2在肝癌组织中表达水平明显高于正常组织。SPATS2表达升高提示肝癌患者恶性临床表型和更差的生存预后，SPATS2具有作为预后标志物的潜在临床应用价值；
2.SPATS2在肝癌细胞系中表达升高；SPATS2基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力、迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降；SPATS2基因敲减后肝癌细胞凋亡率明显升高，促凋亡蛋白表达升高，抑凋亡蛋白降低；细胞周期被阻滞在G1期。SPATS2能够在体外促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力；
3.裸鼠荷瘤实验体内实验证明，SPATS2蛋白能够在体内促进肝癌增殖能力；
4.miR-145-5p能够通过与SPATS2的3’-UTR区结合抑制其表达。过表达miR-145-5p后，肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力明显下降，而过表达SPATS2能够部分逆转miR-145-5p过表达导致的肿瘤抑制作用，miR-145-5p/SPATS2调节轴可影响肝癌细胞的增殖能力；
综上所述，肝癌中异常高表达的SPATS2在肝癌的发生发展中发挥了重要促癌基因的作用，能够通过调控细胞周期和凋亡促进肝癌增殖和侵袭。并且SPATS2受到miR-145-5p的靶向调控。miR-145-5p/SPATS2调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用，有可能成为肝癌治疗的新靶点。
原发性肝癌是世界上最常见的实体肿瘤之一，其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌最常见的病理类型，约占肝癌的75-80％。HCC具有高浸润性和转移潜能，容易转移和复发，五年生存率较低，是目前肝脏相关疾病死亡的主要原因。因此，为了提高肝癌患者的生存率和改善生活质量，探索新型的肝癌早期生物标志物及寻求有效的药物治疗靶点，是当前肝癌研究工作的重点和热点。SPATS2(Spermatogenesis associated serine rich 2)，又名SCR59、p59SCR、SPATA10、Nbla00526。编码该蛋白的基因位于12号染色体上，定位于12q13.12，含有16个外显子，可编码545个氨基酸的多肽。进一步研究发现SPATS2可在25个人体组织中表达。随后的研究表明，SPATS2参与了lncRNASNHG5介导的结直肠癌细胞生长过程。另外，也有研究发现SPATS2与前列腺癌进展有关。然而，SPATS2在肝癌中的表达以及功能尚缺乏全面的研究。
本研究利用生物信息学、分子生物学、RIP等实验手段，结合癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、GEO等公共数据库肝癌表达谱数据集以及具有河南地区遗传背景的肝癌病理组织微矩阵芯片分析了SPATS2在肝癌中的表达及其临床意义；利用体内、外功能实验研究了SPATS2对肝癌增殖、迁移、侵袭及克隆形成等恶性生物学行为的影响；并进一步应用生物信息分析预测及体外实验筛选及验证出能够靶向调控SPATS2的miR-145-5p，并利用功能回补实验系统地研究了miR-145-5p/SPATS2信号轴在肝癌进展中的功能。
我们得出以下结论：SPATS2在HCC组织和肝癌细胞系中上调；SPATS2能够通过调节细胞周期和细胞凋亡促进HCC恶性表型；此外，SPATS2是抑癌基因miR-145-5p的下游靶基因，miR-145-5p可通过负调控SPATS2的表达发挥其肿瘤抑制功能。综上所述，本研究探索了miR-145-5p/SPATS2轴在肝癌的发生和发展中的功能及分子机制，miR-145-5p/SPATS2轴具有作为肝癌预后判断标志物及治疗靶点的可能性。
第一部分SPATS2在肝癌组织中的表达及其与患者临床预后的相关分析
目的：
研究SPATS2在肝癌组织中的表达及其和临床特征及预后的关系
方法：
1.免疫印迹法(Western blot)方法检测SPATS2蛋白在肝癌组织中的表达；
2.免疫组化方法检测SPATS2蛋白在肝癌组织中的表达水平；
3.分析TCGA数据库和GEO数据库中SPATS2mRNA在肝癌组织中的表达水平；
4.在郑州大学(ZZU)肝癌组织芯片队列中探索SPATS2蛋白表达水平与肝癌临床表型、生存预后的相关性，并应用TCGA数据库和GEO数据库进一步分析SPATS2mRNA表达水平和肝癌患者临床特征及预后的关系。
结果：
1.与癌旁组织相比，肝癌组织中SPATS2在mRNA和蛋白水平均呈现高表达；
2.生存分析提示SPATS2高表达的肝癌患者生存期显著短于SPATS2低表达的肝癌患者；
3.COX回归分析证实SPATS2高表达是肝癌患者死亡的独立危险因素，提示SPATS2是潜在的预后标志物。
第二部分SPATS2对肝癌细胞的生物学行为的影响
目的：
研究SPATS2在肝癌细胞系中的表达及其对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及克隆形成等恶性生物学行为的影响
方法：
1.利用Westernblot和免疫荧光检测SPATS2在肝癌细胞系中的表达及定位；
2.利用慢病毒转染技术在肝癌细胞系进行SPATS2沉默，分析SPATS2对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及克隆形成能力的影响；
3.分析SPATS2沉默对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响。
4.生信分析结合体外试验探索SPATS2调控肝癌细胞恶性表型的潜在分子机制；
结果：
1.SPATS2在肝癌细胞中表达较正常肝细胞明显升高；细胞免疫荧光证实SPATS2主要定位于细胞胞浆内；
2.与对照组相比，在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中沉默SPATS2的表达后，细胞增殖、DNA合成和克隆形成能力显著降低；同时细胞的侵袭和迁移能力也受到显著抑制，并且敲减SPATS2可显著抑制迁移相关蛋白(如CXCR4，MMP-2，MMP-7和MMP-9)的表达；
3.与对照组相比，在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中沉默SPATS2的表达后，细胞凋亡水平明显增加；
4.SPATS2基因沉默后，细胞周期相关p21和p27表达水平明显增加，肝癌细胞出现细胞周期停滞。同时出现抗凋亡蛋白Survivin和C-myc水平减低，Bax、Bak、Cleaved-caspase3和CytochromeC促凋亡蛋白显著升高。这些结果表明细胞周期相关通路是SPATS2参与肝癌进展的下游信号通路。
第三部分SPATS2对肝癌增殖和转移能力影响的动物体内研究
目的：
应用动物模型探索体内SPATS2对肝癌增殖和转移能力影响
方法：
1.应用慢病毒转染技术构建SPATS2稳定沉默的人源SMMC-7721细胞系，并建立裸鼠皮下肝癌荷瘤模型，探索SPATS2对裸鼠皮下种植瘤增殖的影响
结果：
1.与对照组相比，降低SPATS2蛋白表达后荷瘤模型的肿瘤增殖速度明显减慢，肿瘤体积减小。
2.和对照组的裸鼠相比，沉默SPATS2基因后，细胞增殖标志物Ki-67的表达降低，肝癌细胞增殖速度减慢，SPATS2蛋白可抑制肝癌细胞的体内增殖能力。
第四部分靶向SPATS2基因的miR-145-5p的筛选与鉴定及其对肝癌细胞生物学行为的影响
目的：
筛选并鉴定参与调节SPATS2表达的miRNA分子，探索SPATS2异常表达的上游分子调控机制
方法：
1.利用生物信息预测方法和双荧光素酶报告实验预测并验证能够靶向结合SPATS2的miR-145-5p；
2.实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和Westernblot进一步验证miR-145-5p靶向调节SPATS2表达作用；免疫共沉淀和相关性分析研究miR-145-5p和SPATS2的相互结合及表达相关性；
3.回补实验研究SPATS2是否介导了miR-145-5p对肝癌细胞恶性表型的抑制作用；
4.回补实验探索SPATS2是否介导了miR-145-5p对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响。
结果：
1.生物信息学分析和细胞实验证实miR-145-5p能够靶向结合至SPATS2的3’-UTR；
2.Pearson相关性分析发现miR-145-5p和SPATS2在肝癌中的表达呈显著负相关；
3.体外实验在mRNA水平和蛋白质水平均证实miR-145-5p能够抑制SPATS2的表达；
4.功能回补实验证实在肝癌细胞中过表达miR-145-5p后，肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力明显下降，而过表达SPATS2能够部分逆转miR-145-5p过表达导致的肿瘤抑制作用；
5.回补实验证实miR-145-5p/SPATS2调节轴对肝癌细胞凋亡和细胞周期相关蛋白有显著影响。
全文结论
1.SPATS2在肝癌组织中表达水平明显高于正常组织。SPATS2表达升高提示肝癌患者恶性临床表型和更差的生存预后，SPATS2具有作为预后标志物的潜在临床应用价值；
2.SPATS2在肝癌细胞系中表达升高；SPATS2基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力、迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降；SPATS2基因敲减后肝癌细胞凋亡率明显升高，促凋亡蛋白表达升高，抑凋亡蛋白降低；细胞周期被阻滞在G1期。SPATS2能够在体外促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力；
3.裸鼠荷瘤实验体内实验证明，SPATS2蛋白能够在体内促进肝癌增殖能力；
4.miR-145-5p能够通过与SPATS2的3’-UTR区结合抑制其表达。过表达miR-145-5p后，肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力明显下降，而过表达SPATS2能够部分逆转miR-145-5p过表达导致的肿瘤抑制作用，miR-145-5p/SPATS2调节轴可影响肝癌细胞的增殖能力；
综上所述，肝癌中异常高表达的SPATS2在肝癌的发生发展中发挥了重要促癌基因的作用，能够通过调控细胞周期和凋亡促进肝癌增殖和侵袭。并且SPATS2受到miR-145-5p的靶向调控。miR-145-5p/SPATS2调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用，有可能成为肝癌治疗的新靶点。