第一部分背景肿瘤是一种严重危害人体健康的疾病,尤其是恶性肿瘤,往往是造成患者残疾、死亡的原因。恶性肿瘤细胞具有无限增殖的能力,同时还具有向远处组织器官转移的能力。恶性肿瘤向远处转移是造成肿瘤患者死亡的重要原因,肿瘤细胞的侵袭与转移是肿瘤细胞与宿主细胞、细胞外基质之间一系列复杂的、多步骤的、多因素相互作用的动态过程：首先,肿瘤细胞从原来肿瘤组织中脱离并向周围侵袭、迁移；其次,肿瘤细胞侵入周围的血管或淋巴管,通过这些管道向远处转移；最后,肿瘤细胞能在远处组织器官中增殖生长。按Liotta等提出的恶性肿瘤细胞侵袭转移的三步骤假说,从分子水平上将这个过程分为：1、粘附；2、降解；3、迁移。骨肉瘤是最常见的原发性骨骼肌肉系统恶性肿瘤,大约占儿童恶性肿瘤的2.4%,10-20岁为骨肉瘤发病的高峰期,与其他肉瘤一样,骨肉瘤主要转移至肺部,由于原发病灶可以通过手术切除,因此肺转移是骨肉瘤的主要致死因素。如何抑制骨肉瘤增殖生长,尤其向远处转移,成为临床治疗骨肉瘤的难题。虽然已经使用了新辅助化疗、抑制肿瘤血管生长和保肢手术相结合的方式,总的5年无瘤生存率仍仅有65%。随着对肿瘤发生发展过程中分子路径多样性的认识,分子靶向治疗成为临床治疗肿瘤、提高肿瘤患者生存率的研究热点。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是1992年Hansks等在转染的v-src鸡胚成纤维细胞中首次发现并克隆鉴定出来的。FAK是一种非受体络氨酸激酶,人的FAK基因定位于人体8q24, cDNA全长4285bp,编码1028个氨基酸,相对分子质量为125kDa,在结构上,FAK包括一个N-氨基端FERM调节结构域、一个中央催化酶结构域、两个富含脯氨酸的主链及一个羧基端粘着斑结构域。FAK在生物进化过程中高度保守,故物种间的同源性高达90%。FAK广泛分布于人体内各种细胞,包括成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞等。FAK可以介导细胞多条信号转导通路广泛参与细胞的多种生物学过程,并参与肿瘤的发生发展、侵袭与转移、血管的生成。FAK在对肿瘤细胞的迁移、侵袭密切相关,其可通过介导细胞信号通路,引起细胞骨架的变化,从而引起细胞迁移、侵袭。虽然诸多实验证实在许多恶性肿瘤组织(乳腺癌、肺癌、前列腺、肝癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌等)中发现FAK出现高水平的表达,并对肿瘤的侵袭转移发挥重要作用,但是对于其在骨肉瘤中的表达情况、FAK在骨肉瘤发生发展中的作用及机制却是少有报道。因此FAK的在骨肉瘤中的表达及设想通过抑制FAK转录活性及功能探讨其在骨肉瘤发生发展的中作用是我们研究的焦点。随着RNA干扰技术的发展,为研究靶向蛋白对肿瘤发生发展开辟新的道路,同时为治疗肿瘤提供了新的方向。第二部分FAK在不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系中的表达的实验研究目的探讨FAK在不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系中的表达。材料和方法1.不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系的分离1.1骨肉瘤143B细胞的单克隆化分离采用有限稀释法,将骨肉瘤细胞143B细胞在96孔板中稀释成每孔1个细胞,镜下观察并记录单克隆孔,加入条件培养基(其中含20%FBS,余下条件同母细胞系的培养)进行培养。37℃,5%CO2培养箱中培养2-3周。待细胞增殖达到每孔面积的1/3时,将细胞转移至24孔板中扩大培养,后再转至6孔板,最后转入培养皿培养。1.2不同迁移能力骨肉瘤亚克隆细胞系的鉴定采用划痕实验鉴定骨肉瘤亚克隆细胞的迁移能力。用记号笔于12孔板每孔背面与划痕平行划5个小圆点,选取生长速度相近的5株亚克隆细胞系,标记为A1、A2、A3、A4、A5接种于做有标记的12孔板中,37℃,5%CO2培养箱中培养。待细胞融合至90%-100%,在单层细胞上,用200μl枪头沿培养板底部做一“1”字型划痕,PBS洗三次,加入培养基,用激光共聚焦显微镜摄像。于每个小圆点附近取划痕区距离(A值),继续培养细胞24小时或划痕愈合,取相同划痕区域迁移后的距离(B值),根据下面公式计算出细胞相对迁移距离。相对迁移距离=(A-B)/A。相同时间内,相对迁移距离较大的亚克隆细胞系为迁移能力较强的亚克隆细胞。实验重复三次。2.不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系中FAK的表达Western blotting检测不同迁移特性骨肉瘤亚克隆细胞系中FAK的表达。将分离出不同迁移能力的骨肉瘤亚克隆细胞系相同细胞数接种于6孔板,37℃,5%C02培养箱中培养。当细胞融合至80%时,弃去细胞培养液,用PBS清洗细胞2次,加入SDS样品缓冲液,刮除细胞,转移到EP管,煮沸样品5min。离心12000rpm离心5min,取上清。取等量样品上样于SDS-PAGE,电泳至溴酚蓝跑到胶底部。转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉4℃过夜封闭,FAK抗体(1：400)、α-Tubulin抗体(1：800)4℃孵育过夜。PBS-T洗膜3次,每次10min。二抗室温孵育2小时,缓慢摇动。PBST洗膜3次,每次10min,加入显色试剂,显影,定影,对x光底片扫描,观测蛋白条带的亮度来确定蛋白表达的高低。3.统计学分析所有数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量数据采用均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较根据各组间方差齐性检验结果选择不同的方法,按0.05检验水准,若组间方差齐同,则采用LSD-t检验,若组间方差不齐,则采用Tamhane’s T2检验。以P≤0.05认为差别有统计学意义。结果骨肉瘤细胞143B的单克隆化分离96孔板中成功分离单细胞生长的约为20个,其中14个克隆成功传至培养皿中继续生长,余下皆发生凋亡或无法继续传代,在同等培养情况下,传至8-12代后,14株亚克隆细胞中又有2株单克隆细胞亚系出现自发性的死亡,而无法继续传代。挑选生长速度相近的5株亚克隆细胞系(A1、 A2、A3、A4、A5)。通过划痕实验发现骨肉瘤亚克隆细胞系A1、A2、A3、A4、A5的相对迁移距离分别为0.458±0.019、0.931±0.010、0.941±0.014、0.617±0.015、0.701±0.018。骨肉瘤亚克隆细胞系A2、A3迁移能力较A1强(P<0.05),而其细胞中FAK的表达亦明显高于其他亚克隆细胞系。结论FAK在迁移能力较强的骨肉瘤亚克隆细胞系中高表达第三部分FAK对骨肉瘤细胞亚克隆细胞系的增殖及迁移作用的实验研究目的探讨FAK骨肉瘤细胞亚克隆细胞系的增殖及迁移作用。材料和方法1.小干扰RNA (siRNA)转染骨肉瘤亚克隆细胞系.将骨肉瘤亚克隆细胞系接种于6孔板中,接种细胞数量以24小时内融合至40%-60%为标准,设立阴性对照组及FAK siRNA组,其中阴性对照组中加入50nM/L阴性对照siRNA转染细胞,FAK siRNA组加入30nM/L、50nM/L、60nM/L浓度的FAK siRNA转染细胞。转染操作按LipofectAMINE2000试剂说明书进行。37℃,5%CO2培养箱中培养6小时后换液,继续培养至48小时后进行转染水平检测。2.小干扰RNA (siRNA)转染水平检测Western blotting检测小干扰RNA转染水平。分别用50nM/L阴性对照siRNA转染细胞,FAK siRNA组加入30nM/L、50nM/L、60nM/L浓度的FAK siRNA转染细胞48小时后,弃去细胞培养液,用PBS清洗细胞2次,加入SDS样品缓冲液,刮除细胞,转移到EP管,煮沸样品5min。离心12000rpm离心5min,取上清。取等量样品上样于SDS-PAGE,电泳至溴酚蓝跑到胶底部。转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉4℃过夜封闭,FAK抗体(1：400)、a-Tubulin抗体(1：800)4℃孵育过夜。PBS-T洗膜3次,每次10min。二抗室温孵育2小时,缓慢摇动。PBST洗膜3次,每次10min,加入显色试剂,显影,定影,对x光底片扫描,观测蛋白条带来确定蛋白表达的高低。3.FAK对骨肉瘤细胞亚克隆细胞系的增殖能力的影响的检测设立空白对照组、阴性对照组、FAK siRNA组,分别加入50nM/L浓度的转染试剂、阴性对照siRNA、FAK siRNA转染迁移能力较强的亚克隆细胞系48小时。将经过转染后的各组细胞按1×104个/孔接种于24孔。37℃,5%CO2培养箱中培养,24小时后,胰酶消化,每组每天计数3个小孔,连续计数4天。描绘各组细胞生长曲线。4.FAK对骨肉瘤细胞亚克隆细胞系迁移的作用4.1FAK骨肉瘤亚克隆细胞系迁移能力的作用的检测设立阴性对照组、FAK siRNA组分别加入50nM/L浓度的阴性对照siRNA、 FAK siRNA转染迁移能力较强的亚克隆细胞系48小时。将经过转染后的各组细胞接种于做有标记(每孔背面与划痕平行划5个小圆点)的12孔板中,37℃,5%CO2培养箱中培养。待细胞融合至90%-100%,在单层细胞上,用200μl枪头沿培养板底部成“1”字形划痕,PBS洗三次,加入培养基,用激光共聚焦显微镜摄像。于每个小圆点附近取划痕区距离(A值),继续培养细胞24小时或划痕愈合,取相同划痕区域迁移后的距离(B值),根据下面公式计算出细胞相对迁移距离。相对迁移距离=(A-B)/A。相同时间内,相对迁移距离较大的亚克隆细胞系为迁移能力较强的亚克隆细胞。实验重复三次。4.2免疫荧光检测板状伪足的形成实验设立阴性对照组、FAK siRNA组,分别加入50nM/L浓度的阴性对照siRNA、FAK siRNA转染迁移能力较强的亚克隆细胞系48小时。将经过转染后的各组细胞爬片生长8小时后,2%PFA室温15分钟固定细胞,PBS清洗细胞3次,每次5分钟。加]FITC-phaloidin (1:500). DAPI (1:500)室温下给细胞染色60分钟。PBS-T清洗细胞3次,每次5分钟。加抗荧光淬灭封片液封片。共聚焦显微镜下观察、摄像。取5-10个不同视野,细胞总数不少于200,计算形成板状伪足的细胞个数,计算占总数的比例。5.统计学分析所有数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量数据采用均数±标准差(x±s)表示。按0.05检验水准,采用两样本t检验、χ2检验进行数据分析,以P≤0.05认为差别有统计学意义。结果通过生长曲线发现FAK表达下调前后骨肉瘤亚克隆细胞系A3生长趋势无明显变化,而当对FAK"敲除”后,FAK siRNA组的细胞相对迁移距离为0.322±0.01,较阴性对照siRNA组(0.942±0.025)明显降低(P<0.05)。同时,FAK-siRNA组中细胞形成板状伪足细胞数量的比例为12.8%,与阴性对照组相比(33.3%),明显减少(P<0.05)。结论1.FAK对骨肉瘤细胞的增殖无明显作用；2.FAK可能通过影响板状伪足的形成,从而影响骨肉瘤细胞的迁移能力。