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目的:在全球范围,心血管疾病的发病率及致死率均为首位,每年因此病致死人数高达1760万,并且在2030年该数字预计将会上升至2360万人[1]。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是大部分心血管疾病的病理基础。AS斑块破裂导致动脉栓塞是心血管事件的直接原因。尽管对于心血管病有许多治疗方式,但其致死率仍呈逐年上升态势。为此,明确AS的发生、发展特点及其相关机制,开发新的干预措施,是降低高危人群心血管发病率和死亡率亟待解决的首要问题。炎症是斑块破裂和急性心血管事件发生的关键因素。虽然影像技术可以帮助识别易损粥样硬化斑块,但仍有图像质量、有创及辐射等不可避免的局限性,目前尚缺乏非侵入性的方法,如斑块炎症的血浆标记物,以帮助识别易损斑块的存在。细胞/趋化因子在各种炎症性疾病,包括AS等中发挥关键作用[2],其中白细胞介素1（Interleukin 1,IL-1）作为炎症的主要调节因子,经典的IL-1-IL-6-CRP炎症通路是促进AS的重要机制之一,白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）被证明与未来心血管事件和卒中的风险密切相关[3-5]。具有代表性的巨噬细胞在AS病变的病理进展中起着重要作用[6],其迁移、活化、浸润和增殖导致AS斑块的形成[7],巨噬细胞还分泌多种细胞因子及蛋白酶,加重炎症、脂质沉积并促进斑块破裂[8,9]。单核/巨噬细胞表型和功能随着微环境的变化而改变,在AS发生发展的不同阶段,受多种微环境因子的影响,发挥促进或抑制AS的作用。与单核/巨噬细胞相关的细胞因子如单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1/CCL2）[10]、巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）及巨噬细胞炎性蛋白1β（Macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β）等[11]与心脑血管栓塞事件密切相关。临床上,尽管以血管造影为AS诊断的金标准,但受其有创、辐射、操作复杂且费用较高等缺点限制,并未广泛地应用于临床检查。超声检查具有简便易行、性价比高等优点,是临床AS筛查的主要手段[12]。通过超声检查颈动脉内-中膜厚度（Carotid Intima and Media Thickness,c IMT）及斑块（Plaque）反应AS负荷水平,颈动脉IMT增加提示全身性的AS[13],c IMT/plaque作为心血管疾病的独立危险因素,与高血压、吸烟史、高脂血症等传统危险因素之间有良好的相关性[14],并且可以更好评估患者发生心血管栓塞的风险[15,16]。超声和血清指标从不同角度能够反应AS进展程度,但目前超声指标与血清细胞因子等指标结合的研究尚不全面,将二者结合不论是对AS早期干预还是对高危患者临床事件发生的预防均具有重大意义。目前临床上对于AS的治疗主要途径是服用他汀类药物,通过降低血脂达到控制AS进展的目的,但传统的治疗方法生物利用度低、副作用大,在安全性和有效性方面远远不能满足临床对长期给药的要求[17]。目前一项以抗白介素1β（Interleukin 1β,IL-1β）单克隆抗体（卡那单抗）治疗AS的临床试验（CANTOS trial）结果表明抗IL-1β抗体可以显著降低心肌梗塞患者IL-6及C反应蛋白（C reactive protein,CRP）水平,并降低有炎症残余的心梗患者再次发生心血管事件风险[18],而不改变患者血脂水平。关于抗IL-1β抗体干预对外周循环血脂、细胞因子、免疫细胞及斑块构成的影响及动态变化的研究较少,抗IL-1β抗体对AS患者机体具体产生怎样的影响仍需进一步研究。维生素D（Vitamin D,VD）可以控制骨骼病理/生理,调节钙、磷和骨骼重塑以及其他钙调节激素,在心血管疾病方面,VD缺乏与促炎症机制的激活有关,促进AS发生,补充VD可以降低栓塞事件风险[19]。另一些研究认为VD可能增加血管壁钙化程度及栓塞风险。此外,VD可以通过表观调控影响部分免疫细胞的表型及功能[20],单核细胞受其影响最为显著。对于补充VD是否对AS产生正向影响以及对AS病程中固有免疫细胞的表型和功能造成怎样的影响,目前尚无定论,也需进一步研究。本课题的目的是通过AS不同病程患者颈动脉超声检查的影像学和免疫学特点的系统分析,找到其随病程变化特征,并利用AS小鼠模型,给予抗IL-1及VD处理,对比观察其对小鼠血脂、单核/巨噬细胞表型及斑块形成的相关效应,旨在为AS的临床诊断和治疗评估提供更为科学系统的信息。研究方法:1、选择2019年1月至2019年12月于中国医科大学附属第一医院门诊行颈动脉超声检查患者110例、健康志愿者30例,其中男78例、女62例,平均年龄62.58±10.30。记录一般临床资料:年龄、性别、体重指数（BMI）、饮酒吸烟史、收缩/舒张压。排除标准:（1）出血性卒中;（2）动脉夹层;（3）动脉炎:如多结节性动脉炎、系统性红斑狼疮等;（4）血液系统疾病:真红细胞增多症、白血病等;（5）颈动脉手术治疗史。2、检测外周血生化指标:甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、C反应蛋白（CRP）及肌酐。3、颈动脉超声检查取颈动脉长轴切面,距离颈总动脉分叉部近端1 cm处、颈总动脉分叉部以及颈内动脉起始段1cm处后壁的IMT,各测量3次,取其平均值,同样在静脉长轴切面测量颈动脉斑块的长度,再取短轴切面,测量斑块厚度及宽度,计算斑块体积。根据颈动脉粥样硬化程度分级[21],分为I级:未发生动脉硬化;Ⅱ级:动脉内-中膜出现增厚,但无形成明显斑块;Ⅲ级:形成动脉斑块,但无明显动脉直径狭窄出现（狭窄率<30%）。根据颈动脉狭窄程度进一步分为:轻度狭窄（<30%）;中度狭窄（30-50%）;重度狭窄（>50%）[22]。图像分析及判断标准:根据IMT测值间接判断内膜厚度,正常IMT<1.0mm,1.0 mm≤IMT<1.5mm为内膜增厚,IMT≥1.5mm为斑块形成[15,23]根据斑块回声的高低,常规二维超声将其分为低、中、高及混合回声斑块。4、悬液芯片技术检测外周血清中IL-1β、TNF-α等48种细胞因子。5、给予Apoe-/-C57BL/6小鼠高脂饮食（Western饮食）,建立AS模型,检测小鼠外周血脂水平及主动脉弓斑块形成情况确定模型建立是否成功。6、高脂饮食后4/14/20周,给予部分Apoe-/-小鼠抗IL-1β抗体（300ug/只,i.p.,qod,3次）,另一部分Apoe-/-小鼠在高脂饮食2周后,给予VD治疗（0.1μg/只,p.o,隔日1次）,分别于6/16/22周,收集小鼠外周血,检测血脂指标（TC、TG、LDL、HDL）,流式细胞仪检测单核细胞表型,采用APC-cy7-anti-CD11b和PE-anti-CD115标记外周单核细胞,利用BV510-anti-Ly6C区别巡逻及炎性单核细胞。Ly6Clo表示巡逻单核,APC-anti-CCR2低表达,PE-cy7-anti-CX3CR1高表达的非经典单核细胞;Ly6Chi代表炎性单核细胞,CCR2高表达CX3CR1低表达表示经典单核细胞。Alexa-488-anti-CD36标记细胞泡沫样化。获取主动脉弓标本,HE染色观察小鼠主动脉弓斑块形成及炎性细胞浸润状态,免疫组化进一步观察动脉壁IL-1及IL-6表达水平及i NOS+/Arg I+巨噬细胞表型变化情况。结果:1、颈动脉粥样硬化患者血清白介素1β(IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子水平明显高于正常组,而在病变早期即内膜增厚期,外周血促炎性因子（IL-6、IL-1α等）水平即升高,随着斑块形成进一步上升,同时抗炎性因子IL-4、IL-10等亦增高,单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3也在病变早期水平较高,而巨噬细胞趋化和集落因子MIP-1α、M-CSF在重度狭窄患者中水平升高。2、颈动脉各项超声指标与IL-6、、IL-13及TRAIL均有相关性。IMT与IL-6、IL-2Ra、MIP-1β、IL-1Ra、MCP-1、IL-8、G-CSF、HGF、IL-7、IL-12、TNF-α呈正相关,与IL-6呈显著正相关;斑块回声强度与IL-6呈正相关,与IP-10、IL-13、TRAIL呈负相关;颈动脉狭窄程度与IL-6、TNF-α呈正相关,与IL-13、TRAIL呈负相关;颈动脉斑块数目与GM-CSF、TRAIL、IL-13呈负相关,与IL-6呈正相关;颈动脉斑块体积与IL-6、IL-12、TNF-α呈正相关,而与TRAIL、IL-13呈负相关。3、Apoe-/-C57BL/6J小鼠给予高脂饮食（Western diet）6周后,外周血HDL、LDL、TCHO、TG均显著升高,Ly6Chi单核细胞比例升高,主动脉弓病理显示明显斑块形成,炎性细胞浸润严重。4、给予抗IL-1β抗体治疗后,第16周开始,小鼠外周血HDL、LDL、TCHO、TG较未干预组显著下降,单核细胞整体数目减少,CCR2+Ly6Chi单核细胞比例下降,CX3CR1+Ly6Clo单核细胞比例升高,并且CD36在单核细胞上的表达上调,主动脉弓HE染色显示无明显斑块形成,无明显炎性细胞浸润,免疫组化显示与未干预组相比,IL-1及IL-6表达水平均降低,i NOS+型及Arg I+型巨噬细胞数目比例均明显减少。5、VD治疗后,与未干预组相比,小鼠16周LDL、TCHO及TG水平明显下降,22周时略有上升。与未干预组相比,VD治疗6周时,治疗组的Apoe-/-小鼠单核细胞总体比例显著增加,而当VD治疗至22周时,Ly6Clo的巡逻单核和Ly6Chi的炎性单核在PBMC中的比例均显著下降;CCR2+Ly6Chi和CX3CR1+Ly6Clo单核细胞比例在6/16周时低于未干预组,在22周时略有上升;VD治疗第6周CD36表达明显降低,而在16和22周显著上升。主动脉HE染色显示与未干预组相比,主动脉壁斑块附着情况明显减弱,炎性细胞浸润减少,与正常饮食组相比,管壁相对增厚,弹性减弱。免疫组化结果显示,与高脂饮食组相比,IL-1表达水平降低,IL-6表达无明显变化,同时i NOS+巨噬细胞及Arg I+巨噬细胞数目比例降低。结论:1、血清免疫学指标的升高早于临床症状出现,甚至早于斑块形成,随AS病程进展呈现特有的变化模式,且与影像学指标具有良好相关性,对AS病情判断上体现出一致性,可以为预测疾病的发生、发展提供更简便、科学的信息。2、在AS小鼠模型中,抗IL-1β抗体及VD均可以抑制斑块形成,调节小鼠血脂水平,增加非典型单核细胞比例,减少斑块内巨噬细胞数目,降低血管壁炎症水平,整体上抑制炎性细胞向血管壁的浸润,其中抗IL-1β抗体整体抗炎效应较VD更为显著。3、抗IL-1β抗体及VD均可以上调单核细胞CD36水平,在抗炎环境的前提下,单核细胞CD36的上调可以有助于降低血脂水平。