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前言目前大量的研究和实践结果表明,严重威胁妇女健康的宫颈癌是唯一一种经过医学干预使发病率和死亡率下降的人类恶性肿瘤。有无淋巴结转移是影响宫颈癌预后的最重要因素之一。研究表明,病理证实有淋巴结转移的患者在术后辅加放疗和(或)化疗,可以使宫颈癌的术后复发率降低,提高生存率。因此早期宫颈癌患者区域淋巴结有无转移的检测直接决定了治疗方案的选择,而影响疾病的预后。微转移是指常规病理检查方法难以发现的播散的孤立存在的肿瘤细胞。随着免疫组织化学和分子生物学的进步,使常规病理学HE染色不能发现的单个的隐匿的肿瘤细胞能够被检测出来,为宫颈癌的淋巴微转移研究提供了新的检测手段。以往的研究以角蛋白(cytokeratin,CK)为检测指标,利用不同方法检测常规病理检查阴性淋巴结的微转移检出率有较大差别,有报道免疫组织化化学方法(immunohistochmistry,IHC)的检出率为8-15%;而聚合酶链反应方法(polymerasechain reaction,PCR)的检出率为44%,检出的患者微转移率为50%。此外,整合于宫颈癌细胞核中的HPV DNA被应用于宫颈癌淋巴微转移的检测,PCR法测得HPV16 DNA的宫颈癌病理阴性淋巴结的微转移率为26.3%-38%。本研究采用定位更准确,特异性更强、无内源性干扰的原位杂交方法(In site hybridization,ISH)测高危型HPV DNA,联合免疫组化法检测CK19来共同探讨早期宫颈癌淋巴结中微小转移灶的检测方法,及其与各临床病理特性的关系,同时对上述两种检测方法进行简单的比较。实验材料与方法一、标本来源及试剂选择28例2003年～2005年于中国医科大学附属盛京医院行宫颈癌根治术患者,术前均未经过放化疗,无其他内外科合并症。采用(FIGO 2000)的临床分期标准,Ⅰ期15例,Ⅱ期13例。其中鳞癌26例,腺癌2例。病理分级:高分化7例,中分化14例,低分化7例。患者年龄26～60岁,平均年龄41岁,中位年龄41岁。其中常规病理光镜检查证实有淋巴结转移的13例,无淋巴结转移的15例。选择上述28例宫颈癌患者的原发病灶,左右闭孔、左右髂内淋巴结石蜡标本,进行检测。平均每名患者取3～4个淋巴结,共选取淋巴结104个。淋巴结根据常规病理光镜检查转移情况分为3组:淋巴转移患者转移淋巴结组,淋巴转移患者未转移淋巴结组,淋巴无转移患者淋巴结组。高危型HPV DNA原位杂交DIG染色系统试剂盒(FISH 2004 HPV)购于天津灏洋生物公司;CK19单克隆抗体及UltraSensiveS-P免疫组化及DAB显色试剂盒均购于福州迈新生物技术公司。二、切片制备选取的宫颈癌石蜡标本及淋巴结石蜡标本进行连续切片,厚度为4μm,HE染色,两位经验丰富病理医生分别确诊为宫颈浸润癌、转移淋巴结,非转移淋巴结的的切片分别进行原位杂交和免疫组化实验。三、原位杂交检测高危型HPV DNA高危型HPV DNA探针设计及合成序列如下:上游5’-CTGTG TAGGT GTTGAGGTAG GTCGT GGTC-3’,下游5’-ATCAT CAACA TTTAC CAGCC CGACGAGC-3’,此探针混合使用可与HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68杂交的阳性模版序列杂交成功。阴性对照不加探针,滴加PBS缓冲液;取10例常规病理光镜检查证实为宫颈癌病灶组织做阳性对照。结果判定:阳性杂交信号呈棕黄色颗粒,定位于细胞核内。四、免疫组化检测CK19利用免疫组化SP法检测CK19,实验步骤同试剂盒说明书。阴性对照不加一抗,代之以PBS缓冲液,阳性对照同前。结果判定:胞浆中出现黄褐色颗粒为阳性结果。五、统计学方法所有统计资料经SPSS 13.0软件进行统计分析,采用X~2检验比较三组高危型HPV DNA检出率有无差别,用Fisher确切概率法分析淋巴结高危型HPV DNA阳性率与年龄、肿瘤分期、病理分级、淋巴结转移的关系。P＜0.05视为有统计学差异。检测结果符合情况采用一致性检验,计算Kappa指数(KI),0.75＞KI＞0.4,定义为一致性良好,KI≥0.75为一致性极好。结果一、三组淋巴结中高危型HPV DNA的表达及其与宫颈癌临床病理参数之间的关系常规病理光镜检查证实有淋巴转移的13名患者的47个淋巴结中,常规病理光镜检查证实有转移的24个淋巴结中23个呈高危型HPV DNA阳性,阳性率为95.8%。常规病理光镜检查证实无淋巴转移的15名患者的57个淋巴结中,23个高危型HPV DNA阳性,阳性检出率为43.5%。所有高危型HPV DNA阳性淋巴结来自9名患者,微转移患者检出率为60%(9/15)。在所有常规病理阴性的淋巴结中高危型HPV DNA的阳性检出率为45%(36/80)。比较三组淋巴结高危型HPVDNA阳性检出率,淋巴转移患者转移淋巴结组高危型HPV DNA的阳性检出率明显高于淋巴转移患者未转移淋巴结组,及淋巴未转移患者淋巴结组(P＜0.001)。FIGO分期Ⅰ期患者淋巴结中高危型HPV DNA的检出率为78.6%(10/14),而Ⅱ期的检出率为85.7%(12/14),随着分期增加淋巴结中高危型HPV DNA的检出率有增高的趋势,但是无统计学意义(P＞0.05)。随着分化程度的降低,淋巴结中高危型HPV DNA的检出率也逐渐增高,无统计学意义(P＞0.05)。淋巴结中高危型HPV DNA的检出率与患者的年龄无关(P＞0.05)。二、三组淋巴结中CK19的表达及其与宫颈癌临床病理参数之间的关系在淋巴转移患者中,常规病理光镜检查证实有转移的24个淋巴结中23个呈CK19阳性,阳性率为95.8%。常规病理光镜检查证实无淋巴转移的15名患者的57个淋巴结中,14个CK19阳性,阳性检出率为24.6%,14个阳性淋巴结来自7名患者,微转移患者检出率为46.7%(7/15)。在所有常规病理阴性的淋巴结中CK19的阳性检出率为25%(20/80)。比较三组淋巴结CK19阳性检出率,转移患者转移淋巴结组,明显高于转移患者未转移淋巴结组及未转移患者淋巴结组(P＜0.001)。三、两种方法的检测结果的一致性检验原位杂交法检测高危型HPV DNA和免疫组化法检测CK19在宫颈癌淋巴结微转移检测中检测结果的一致性良好。结论原位杂交法检测高危型HPV DNA,免疫组化法测CK19均可检测出早期宫颈癌淋巴结微转移,原位杂交法是分子水平的检测,在宫颈癌淋巴微转移的检测中可能更敏感可靠。