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研究背景宫颈癌是一种女性生殖系统肿瘤,为最常见的女性恶性肿瘤之一。近年来,其发病率与死亡率逐渐升高,严重威胁女性健康。现阶段关于宫颈癌发生发展机制尚未完全阐明,近年来研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在宫颈癌发生发展中关键作用,研究表明,lnc RNA可作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ce RNA),通过竞争性的结合微小RNA(micro RNA,mi RNA)以抑制其活性与功能,从而调控下游靶基因m RNA的表达,参与肿瘤发生进展。Lnc RNA TDRG1是近年来新发现的对基因表达具有调控作用的长链非编码RNA,已有文献报道其在睾丸生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌等中与肿瘤恶性进展有相关性,可能为调控生殖系统肿瘤的关键因子,然而,TDRG1在宫颈癌进展中的调节机制尚不清楚,需要我们进一步探讨。研究目的本研究旨在探讨lnc RNA TDRG1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。第一部分TDRG1在宫颈癌组织中的表达差异及临床意义研究方法1.收集30例宫颈癌组织和30例正常宫颈组织,采用q RT-PCR检测TDRG1的表达水平;2.分析TDRG1表达水平与宫颈癌患者临床病理特征、预后的关系;3.通过生物信息学软件分析出TDRG1靶目标mi R-326,q RT-PCR检测宫颈癌组织中mi R-326的表达情况,Spearman相关性分析mi R-326表达与TDRG1表达之间的相关性;4.通过生物信息学软件分析出mi R-326的下游靶标MAPK1,q RT-PCR检测宫颈癌组织中MAPK1 m RNA的表达情况,Spearman相关性分析MAPK1表达与TDRG1、mi R-326表达之间的相关性。研究结果1.宫颈癌组织中TDRG1表达水平高于正常宫颈组织;2.TDRG1表达水平与宫颈癌患者FIGO分期(IIb-IIIa)、肿瘤分化(低)、宫颈浸润深度(≥2/3)和淋巴结转移(有)呈显著正相关;3.宫颈癌患者中TDRG1高表达者总生存期平均值小于TDRG1低表达者;4.q RT-PCR检测结果显示宫颈癌组织中mi R-326表达水平低于正常宫颈组织,Spearman相关性分析显示TDRG1表达和mi R-326表达呈负相关;5.宫颈癌组织中MAPK1 m RNA表达高于正常宫颈组织,Spearman相关性分析显示MAPK1表达与TDRG1表达呈正相关,与mi R-326表达呈负相关。研究结论1.TDRG1在宫颈癌组织中呈高表达;2.TDRG1的高表达增强宫颈癌侵袭力,与宫颈癌患者FIGO分期(IIb-IIIa)、分化程度(低)、淋巴结转移(有)、宫颈浸润深度(≥2/3)以及预后不良呈正相关;3.TDRG1表达和mi R-326表达呈负相关;4.TDRG1表达与MAPK1表达呈正相关,mi R-326表达与MAPK1表达呈负相关。第二部分TDRG1对宫颈癌细胞生物学行为的影响研究方法1.采用q RT-PCR检测人宫颈永生化鳞状细胞(Ect1/E6E7)和人宫颈癌细胞系(Hela,SIHA,Ca Ski)中TDRG1的表达水平,选取目标研究对象;2.在Hela细胞中下调TDRG1表达,采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验检测Hela细胞生物学行为变化。研究结果1.Hela,SIHA,Ca Ski细胞中TDRG1表达水平高于Ect1/E6E7,因Hela细胞TDRG1表达水平更高,选取其进行后续试验;2.克隆形成实验结果显示下调TDRG1表达的细胞克隆数目减少;MTT实验结果显示下调TDRG1表达的细胞生长曲线降低;流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1表达细胞凋亡增加;3.细胞划痕实验结果显示下调TDRG1表达的细胞划痕愈合较慢;transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1表达的细胞侵袭数量减少。研究结论1.TDRG1在人宫颈癌细胞系中呈高表达;2.下调TDRG1表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。第三部分TDRG1通过mi R-326/MAPK1轴调控宫颈癌细胞增殖,迁移及侵袭研究方法1.采用双荧光素酶报告实验和RIP实验,验证TDRG1与mi R-326的相互关系;2.将Hela细胞与TDRG1 si RNA和mi R-326 inhibitor共转染,采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验研究其生物学行为的变化;3.采用q RT-PCR和western blot检测上调/下调TDRG1或mi R-326对靶基因MAPK1的m RNA和蛋白表达水平变化。研究结果1.双荧光素酶报告实验显示mi R-326可降低TDRG1的荧光素酶活性,RIP实验显示TDRG1可特异性富集mi R-326;2.与第二部分实验结果相比,克隆形成实验结果显示下调TDRG1及mi R-326表达的细胞克隆数目增加;MTT实验结果显示下调TDRG1及mi R-326表达的细胞在490nm处的吸光值升高;流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1及mi R-326表达细胞凋亡减少;3.与第二部分实验结果相比,细胞划痕实验结果显示下调TDRG1及mi R-326表达的细胞划痕愈合距离增加;transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1及mi R-326表达的细胞侵袭数量增加;4.MAPK1 m RNA及蛋白表达与mi R-326表达与呈负相关;MAPK1 m RNA及蛋白表达与TDRG1表达呈正相关。研究结论1.TDRG1可与mi R-326特异性结合且二者表达水平呈负相关;2.下调mi R-326表达可部分逆转下调TDRG1表达对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用;3.mi R-326抑制MAPK1表达,TDRG1增强MAPK1表达;TDRG1可作为ce RNA竞争性吸附mi R-326,抑制mi R-326活性和功能,上调MAPK1表达水平;4.TDRG1通过调控mi R-326/MAPK1轴调节宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力以发挥其致癌性,促进宫颈癌发生发展;5.TDRG1可以作为潜在靶标为宫颈癌的诊断、治疗和预后评价提供新思路和新方向。