背景：微流控芯片技术（Microfluidics），又称“芯片实验室”（Lab-on-a-chip，LOC）是把生物学、化学、医学实验室的基本功能和操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，将样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元浓缩于微米级的通道中从而实现对样品快速、准确、便捷的检测，并实现自动化的分析方法。与传统平台相比，它具有集成度高、成本低、灵敏度高、试剂消耗少和检测时间短等优点。逐渐发展起来的微流控芯片技术以其微米级的通道和灵活的设计在目前对细胞的研究中占据非常重要的地位。肺癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤。尽管目前治疗手段不断进步，但由于肺癌易复发和转移并且对化疗药物产生耐药性，死亡率仍然居高不下，其发病机制仍需深入研究。肿瘤的发病机制十分复杂，除了与肿瘤细胞基因的特异性有关，肿瘤微环境对耐药的影响也引起了广泛的关注。研究发现，肿瘤在缺氧、低糖、酸中毒时可以产生内质网应激反应，使细胞内葡萄糖调节蛋白(GRPs)表达增多，它们可能是肿瘤细胞产生耐药的潜在因素，最具代表性的是GRP78这种内质网分子伴侣。本研究小组曾经采用传统实验平台方法对GRP78蛋白表达与肺癌细胞化疗耐药的相关性进行了分析和探讨，但是GRP78蛋白在间质成纤维细胞中的表达及其与间质细胞化疗药物耐药性分析的报道很少。由于传统平台的方法步骤繁琐，实验耗时、耗材较多，灵敏度欠佳。因此，在本研究中我们采用微流控芯片这一新兴的技术平台，利用微流控芯片的手段对肿瘤细胞进行操作和控制，进行肺癌细胞化疗耐药性研究；通过对从芯片平台收集的肿瘤细胞分泌物进行检测分析，以期得到肿瘤微环境中扮演重要角色的物质的结构和含量信息；通过肺癌细胞与肺成纤维细胞非直接接触共培养，探索细胞间信号传导的研究，观察共培养过程中成纤维细胞GRP78蛋白表达的变化，通过对肺成纤维细胞以化疗药物刺激，进行了间质细胞化疗耐药性研究。本研究内容分为四个部分。研究内容：1、微流控芯片细胞共培养检测平台的构建。选取PDMS为芯片材料，制作了含有不同形状的上游二维细胞培养池，筛选出最利于细胞生长的芯片通道条件，构建上游二维的细胞培养体系。制作了不同下游培养基灌流模式的三维培养池，筛选出最适合三维细胞培养的生存微环境，构建下游三维细胞培养体系。位于上游二维培养池和下游三维培养池之间设计了一排微柱结构，微柱结构的设计能够有效的拦截上游细胞在二维培养池内，而细胞分泌的细胞因子能够随着培养基的连续供给，像下游区域流动，连续为下游的三维培养池内细胞提供细胞分泌的细胞因子，实现了细胞非直接接触共培养模式。2、微流控芯片细胞共培养平台中细胞的培养及药物干预研究。分别在不同细胞培养体系中进行了肺癌细胞的二维培养、肺成纤维细胞的三维培养、肺癌细胞/肺成纤维细胞非直接接触共培养，通过显微镜下动态观察不同培养模式下细胞的生长状态。在细胞处于良好生长状态的前提下，分别于不同的培养模式中进行细胞分组及药物干预，以实现不同的平行对照实验条件。3、微流控芯片细胞共培养平台的细胞耐药性检测及分析。在二维细胞培养体系中，NCI-H460肺癌细胞培养及分组药物干预后，用免疫荧光细胞化学的方法检测细胞GRP78蛋白的表达水平，用Western-blotting方法进一步证明它们的表达水平；Hoechst33342染色方法确定细胞在化疗药物VP-16作用下的生存率。在肺癌细胞、肺成纤维细胞共培养体系中，同样采用免疫荧光细胞化学的方法检测肺成纤维细胞经肺癌细胞诱导后α-SMA和GRP78蛋白的表达，采用Hoechst33342、PI双染色法确定肺成纤维细胞经肺癌细胞诱导后在VP-16药物作用下的生存率。根据耐药相关蛋白的表达及细胞在化疗药物作用下的生存率分析GRP78蛋白的表达在肺癌细胞及肺间质成纤维细胞对VP-16化疗耐药中的作用。4、基于微流控检测平台的细胞因子筛选及验证。在二维细胞培养体系中，NCI-H460肺癌细胞贴壁培养6小时后，在培养基出口处于不同的时间点收集培养基的上清液，应用ELISA的方法检测上清液中细胞因子TGF-β1的分泌水平。在三维细胞培养体系中，HFL1肺成纤维细胞培养及分组药物干预后，采用免疫荧光细胞化学的方法检测肺成纤维细胞中α-SMA和GRP78蛋白的表达，明确细胞因子TGF-β1在肺成纤维细胞转化及耐药中的作用。结果：1、微流控芯片细胞共培养检测平台的构建。在芯片上设计了两组平行的培养单元，可以实现平行对照实验条件。根据二维细胞培养池形状条件及三维细胞灌注模式的筛选结果，构建了1)适合NCI-H460肺癌细胞生长的圆形细胞培养池。2)微柱的设计，能够有效的拦截肺癌细胞在圆形培养池区域，微柱之间的间隙允许培养基通过，肺癌细胞分泌的细胞因子可以随着培养及通过，实现了非直接接触共培养方式，有效的分析肺癌细胞分泌液对成纤维细胞转分化的作用。3)三维的HFL1细胞培养池采用培养基侧流的灌注方式。该体系中以注射泵驱动芯片通道内的液体流动，形成了流动介质下的细胞培养条件，更好的模拟了体内生理条件下血液的流动，对细胞营养物质的供应，更接近体内的动态微环境。2、微流控芯片细胞共培养平台中细胞培养及药物干预研究。在芯片动态流动介质条件培养结果显示，上游的二维细胞培养体系下，NCI-H460肺癌细胞贴壁良好，生长状态较佳，存活时间相对较长。下游的三维细胞培养条件下，HFL1肺成纤维细胞在基质胶里伸展较好，生长状态佳。NCI-H460细胞分泌的细胞因子可以渗透入三维基质胶里作用于HFL1成纤维细胞。将各体系中细胞分为实验组和对照组，实验组细胞分别进行了相应的在线药物干预处理。上游二维培养的肺癌细胞用钙离子拮抗剂A23187诱导GRP78的表达；三维培养的成纤维细胞通过与肺癌细胞的非直接共培养诱导α-SMA与GRP78的表达；此外，为测定两种细胞药物作用下的生存率，应用化疗药物VP-16对两种细胞进行凋亡诱导。3、微流控芯片细胞共培养平台的细胞耐药性检测及分析。二维培养的肺癌细胞检测中，免疫荧光细胞化学方法及Western-blotting方法检测结果一致，NCI-H460细胞A23187诱导组GRP78的表达较对照组明显增高。化疗药物VP-16作用下，A23187诱导组的生存率较对照组降低。应用GRP78功能抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）可以抑制A23187诱导的GRP78的增高，进而抑制GRP78增高导致的肺癌细胞耐药；三维培养的成纤维细胞检测中，免疫荧光结果显示在肺癌细胞的诱导下，肺癌细胞诱导组与对照组相比，α-SMA和GRP78的表达显著增高，肺癌细胞诱导组细胞生存率明显增高(P<0.05)，EGCG可以抑制肺癌细胞诱导的成纤维细胞的耐药。4、基于微流控检测平台的细胞因子筛选及验证。通过芯片平台，收集肺癌细胞诱导组和对照组的培养基，应用ELISA方法，验证了肺癌细胞分泌的TGF-β1因子明显增高(P<0.05)。应用外源性TGF-β1因子纯品作用于成纤维细胞后，HFL1细胞α-SMA和GRP78的表达明显增高，表明肺癌细胞NCI-H460细胞对成纤维细胞的影响可能是由TGF-β1介导的。结论：1、构建了可以应用于多种细胞培养体系的微流控芯片装置，在此平台上可以实现肺癌细胞二维培养、肺成纤维细胞三维培养、肺癌细胞/肺成纤维细胞非直接接触共培养。上游二维的培养体系可以用于肺癌细胞的培养、GRP78的表达的检测及化疗药物作用下细胞生存率检测。而细胞共培养培养模式可以使成纤维细胞在三维培养条件下接受肺癌细胞分泌的细胞因子的刺激，更好的模拟了体内三维的生存微环境，并用于成纤维细胞α-SMA和GRP78表达检测及化疗药物作用下细胞生存检测。下游三维培养体系可应用于细胞因子筛选鉴定。2、本部分研究得出以下结论：1)在不同的微流控芯片培养体系上，都可以实现在流动介质条件下的细胞培养，并且无论是二维培养还是三维培养，细胞都生长良好。2)在不同培养条件下完成了细胞在线药物干预。3、本部分得出以下结论：1) A23187诱导的GRP78表达上调与肺癌细胞NCI-H460对VP-16的耐药有关，并且A23187诱导的GRP78上调可以被EGCG抑制，从而抑制了GRP78上调导致的细胞对VP-16的耐药。2)肺成纤维细胞HFL1可以被肺癌细胞NCI-H460分泌的细胞因子刺激、诱导，转化成癌相关成纤维细胞，表现为α-SMA蛋白表达增高。同时我们也观察到GRP78表达也上调，并且GRP78的上调与癌相关成纤维细胞对化疗药物VP-16耐药有关。4、本部分得出以下结论：NCI-H460肺癌细胞可以分泌出肿瘤转化生长因子TGF-β1，且TGF-β1与肺成纤维细胞的转分化及GRP78表达上调密切相关。