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植物具有快速产生大量不同种类的次级代谢产物的能力,主要包括过氧化氢,乙醛以及其它酒精衍生物,用以响应入侵病原微生物诱导产生的持续刺激。这些次级代谢产物的产生代表宿主已启动基因层面的抗病反应,这在很大的程度上被认为是最有效且能在宿主体内被快速被激活的早期防御机制之一。很多植物都能通过这种机制用抵御入侵的病原体,进而提高自身的免疫能力。 实际上,这种形式的抗病反应就是我们通常所说的PTI。PTI一旦被激发,侵染部位细胞将迅速产生并积累具有高度活性的代谢物。这些代谢物能够产生充分的毒性以扼杀病原体,或者抑制它们在宿主细胞中的生长和繁殖。以乙醛以及其他酒精衍生物为主要成分,这些次级代谢产物共同组成了寄主植物抵抗寄生微生物的化学“军火库”。显然,植物病原体为成功侵染宿主必须克服这个先天的化学屏障。为了阐明在与宿主互作过程中,病原真菌通过什么机制化解宿主细胞中大量乙醛造成的危机,我们通过生物信息学、功能基因组学以及蛋白质组学等手段队稻瘟病菌ALDHs相关基因进行分类,病理生理功能研究,以及互作蛋白鉴定。 醛脱氢酶是一类进化上保守的多态酶,隶属于一个 NAD(P)+依赖的酶超家族,催化一个不可逆的氧化反应:将内源和外源乙醛转化为相应的羧酸。因此,从根本上消解胞内外乙醛的毒性。醛脱氢酶超家族的成员之间差异较大,它们定位在不同的细胞组分,参与调控不同的代谢和生物合成途径。自从18世纪早期亚洲爆发了第一次有历史记录的稻瘟病之后,这种快速变异的病原真菌席卷了全球86个主产区,造成的水稻减产量足以养活六千万人口,相当于我们要利用有限的劳动力、水资源和耕地将水稻产量从现在每年5亿吨提高到7亿吨才能填补稻瘟病所造成的国际粮食空缺。因此,我们坚信,本研究是具有重要性和时新性的。根据稻瘟数据库序列比对结果,我们找到16个假定的醛脱氢酶基因,并通过系统进化树分析这些醛脱氢酶基因在稻瘟病菌以及相关真菌中的保守性。然后利用同源重组和RNA沉默技术分别获得稻瘟病菌13个醛脱氢酶超家族基因的敲除或者RNAi沉默突变体。 随后,我们对这些醛脱氢酶编码基因敲出突变体进行一系列的生物学分析,以明确这些ALDHs蛋白在稻瘟病菌生长发育过程中的生理功能。 我们的研究结果表明,稻瘟病菌中绝大多数的醛脱氢酶都具有促进细胞增殖以及增强营养发育的功能。 此外,我们发现所有醛脱氢酶基因敲出突变体的产孢量都明显下降,表明这些基因都在产孢过程发挥重要作用。进一步研究发现,一些底物特异性的醛脱氢酶,包括 MoMET、MoFAT和 MoSAL,对稻瘟病菌致病过程都具有关键的作用,它们的基因敲除突变体对水稻以及大麦都不致病。 此外,我们首次发现,MoMET通过调控附着胞发育相关的信号通路,影响稻瘟病菌芽管发育以及附着胞的形成。实验结果表明,ΔMomet突变体以类根出芽的形式形成异常的萌发管。 在本研究中我们还发现醛脱氢酶突变体对酒精具有专一敏感型,但是,对 ROS、SDS、NaCl和DTT等其它渗透因子表现出中度到较强的适应性。 对一些广泛底物醛脱氢酶的研究结果表明,多数宽底物醛脱氢酶只影响稻瘟病菌的毒性但是不影响其致病性。但是,其中两个蛋白(MGG_00719和 MGG_07890)对于稻瘟病菌致病性也具有重要作用,其基因敲除突变体对水稻和大麦都不致病。 除此之外,我们通过研究发现MoPOT敲出突变体的孢子形态异常而且不具侵染能力。这个结果表明MoPOT参与稻瘟病病菌分生孢子形态建成过程。 最后,我们发现稻瘟病病菌中醛脱氢酶还具有渗透保护剂的功能,大多数醛脱氢酶缺失突变体具有高发性的细胞破裂现象。 综上所述,我们所研究的醛脱氢酶功能完全缺失(敲除突变体)或者部分缺失(RNAi沉默突变)后,都明显影响稻瘟病菌的生长发育、致病性和毒性。由此我们推断,稻瘟病病菌中大多数的醛脱氢酶都可以作为潜在的靶点,用以开发持久的抗瘟新药。