研究背景和目的恶性胶质瘤是一种特别致命的癌症,具有高侵袭性的特点。世界卫生组织(WHO)根据形态学标准传统上将成人脑胶质瘤归类为4个等级,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。与其它癌症细胞不同的是,神经胶质瘤细胞能侵袭到周围的脑组织中。神经胶质瘤细胞具有这种弥漫性侵袭也是导致手术治疗失败的主要原因。当被诊断出有神经胶质肿瘤时,神经胶质瘤细胞已经侵袭了很大范围,这一范围远远超出了其它肿瘤。因此,手术切除肿瘤后,残留的神经胶质瘤细胞能在短短几个月内迅速的形成新的肿瘤。新的治疗性方式例如抗血管生成药物,能够抵抗肿瘤的侵袭性从而降低了肿瘤体积增长速度,但与此同时这些药物有能够刺激神经胶质瘤细胞迁移的副作用。连接蛋白(connexin, Cxs)有着相同的基本结构,其组成包括4个疏水的跨膜片段、亲水段位于中间形成1个胞内环和由6个保守的半胱氨酸残基构成的2个胞外环,蛋白的羧基末端和氨基末端均位于细胞质内。Cxs的羧基末端呈现多样性并被认为是关键部位,并在蛋白间相互作用过程中发挥着极其重要的调节作用。缝隙连接(Gap junctions, GJs)是由Cxs基因家族的编码的蛋白组成(其中,组成人类的Cxs基因家族大约有21个成员)。这些连接蛋白集合在一起就形成了细胞间通道,从而使氨基酸、核苷酸、代谢物和二级信使(如：钙离子、葡萄糖、cAMP, cGMP, IP3)顺利通过细胞膜,但大分子物质除外(小RNAs也可能通过)。细胞间形成的缝隙连接通讯(gap iunctional intercellular communication, GJIC)在控制细胞增殖、胚胎发育、细胞分化以及心肌和平滑肌的协同收缩等多种细胞进程方面都发挥着至关重要的调节作用。GJs分布非常广泛,除成熟的红细胞、精子、骨骼肌外,几乎所有其它类型的细胞都有GJs的存在。虽然GJs在各细胞类型中有一些共同特性,但也会因不同亚型,细胞和组织从而表现出特定的特征。到目前为止,已有21种Cxs的亚型被发现。在大脑,神经元细胞(Cx43, Cx32, Cx36),少突胶质细胞(Cx32, Cx47, Cx29),星形胶质细胞(Cx43, Cx30, Cx26)和小神经胶质细胞(Cx43, Cx32, Cx36,)中均有表达不同Cxs亚型；遗传连锁分析表明：Cxs至少与14种人类疾病有关联--其中许多疾病在通过构建小鼠联接蛋白突变体模型进行成功模拟。Cxs在不同组织中的表达差异,确保了它们在不同细胞、组织中扮演了多样化的生理角色。最近研究发现Cx43在促进细胞迁移中有重要作用,如参与正常大脑发育、增强神经胶质瘤入侵。GJIC、Cx43的羧基端尾部以及Cx43的胞外环形成细胞间粘附而被认为在促进细胞运动性方面有着极其重要作用。此外,Cx43的羧基端尾部与多种细胞骨架蛋白有直接的相互作用,包括肌动蛋白、微管、肌动蛋白结合蛋白,紧密连接和粘附连接蛋白,这些细胞骨架蛋白也与细胞的细胞的运动性相关。此外,Cx43的微管结合域也直接影响着心外膜细胞的迁移。在肿瘤组织中,随着肿瘤的扩散及肿瘤分级的增加Cx43的表达减少。在一个44人肿瘤样本的研究中发现,高级神经胶质瘤中Ki67的增殖指数的增加会引起Cx43蛋白和其mRNA表达的减少。然而,最近的一项32人的样品研究报告指出,在高级神经胶质瘤中,Cx43呈现出的高mRNA水平和低蛋白质水平,这表明Cx43蛋白存在转录后调节。事实确实如此,Cx43的磷酸化状态及其分布是随肿瘤分级的不同而有所不同的。有研究表明,低级的神经胶质瘤较高级的神经胶质瘤相比有较高的Cx43蛋白水平且主要分布在膜表面。肿瘤的发生、发展及转移与Cx43的表达异常有着密不可分的关系,Cx43异常表达现象在许多种肿瘤细胞中均有发现,例如：前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌等细胞中,同时这些肿瘤细胞的细胞间通讯功能也会表现出下降甚至缺失。在许多脑肿瘤细胞中检测到Cx43的表达降低,Hossain等通过免疫组化实验分析了18例不同肿瘤级别(Ⅰ～Ⅳ期)的Cx43在神经胶质瘤石蜡组织中的表达水平,在神经胶质瘤Ⅰ、Ⅱ级以及正常脑组织中Cx43的表达水平高,而Ⅲ级中Cx43则是非常低的表达,在Ⅳ级没有观察到Cx43表达,这些结果表明Cx43的表达的高低对神经胶质瘤进展有着非同小可的关系。Murray等采取免疫组化的方法比较Cx43蛋白在良、恶性肾上腺皮质肿瘤与肾上腺癌细胞株(H295)及正常肾上腺中的表达水平,通过检测发现,在良性和正常肿瘤中可观察到Cx43,然而在H295和恶性肿瘤中Cx43的表达则很少甚至没有观察到；同时,与正常细胞相比,存在于肾上腺癌细胞中的GJ斑呈现进行性减少的特点；因此可以通过检测间隙连接蛋白的表达水平来诊断鉴别肿瘤的良恶性,同时为诱导恶性肿瘤中的GJ开创了一种治疗肿瘤的全新方法。细胞对外界的刺激会产生应答,而细胞间这些应答信号的传递方式一直是许多研究关心的问题,现有较多研究证明,蛋白质磷酸化是细胞传递信号最主要的方式。PTK、PKG、MAP、PKA、PKC等多种蛋白激酶在磷酸化水平上对GJ蛋白的调节发挥重要作用,通过使GJ蛋白磷酸化从而改变蛋白的构象,因为构象的改变会使配对的蛋白扭曲和解聚,从而因为结构的变化而带来GJ功能的变化,通过这种调节机制从而可以改变病理状态下细胞间信息交流。相同的作用位点可以与不同的激酶发生作用,不同的位点也可以与相同的激酶发生作用；不同的疾病中或者不同的组织中即使存在相同的激酶,它们调节磷酸化水平的作用也可以是不同的,不同的激酶之间也可以发生相互作用,因为这些复杂的作用机制而形成调节网络。有关研究表明：GJ蛋白磷酸化与MAPK、PTK、PKC的关系可以得出以下几点：1、PKC:TPA或PMA等许多PKC的激活剂能够降低GJ功能,是通过增加多种细胞的Cx43磷酸化水平实现的。在大鼠心肌细胞实验表明TPA能够激活PKC,降低GJ对染料的通透性和单通道传导性,GJ总的传导性却增加。Lampe等得出,Cx43的Ser368位点可被PKC在体内可直接磷酸化,从而使非心肌细胞GJ的对染料的通透性和单通道传导性降低。2、MAPK:Cx43的Ser279和Ser282等位点可被MAPK磷酸化,从而快速短暂性降低缝隙连接通讯。另外,MAPK可以使心肌细胞间电传导性增强,通过增加Cx43的磷酸化程度；而GJ对染料的通透性在非心肌细胞中降低。3、PTK：增加Cx43磷酸化能使缝隙连接通讯发生快速而短暂地破坏,这可能是通过MAPKs间接引起的。Cx43有多个位点可以被磷酸化,是一种非常具有潜力的磷蛋白。有研究指出,在Cx43蛋白的羧基末端,位于氨基酸250-382的范围内,其中有2个酪氨酸被不同蛋白激酶磷酸化以及在21个丝氨酸中至少有12个被磷酸化。多种蛋白激酶的合成、组装、运输及通道的门控特性受Cx43磷酸化的影响,Cx43从而能够调节传递细胞间的信息,由此可见,GJ的功能与Cx43的蛋白表达量及磷酸化的关系密不可分。为了更好地研究分析机体内一些信号通路机制是如何受磷酸化影响的,于是对GJ蛋白磷酸化及其特异性位点的详细全面分析探讨显得尤为必要。总之,尽管有大量研究揭示了缝隙连接蛋白的磷酸化机制以及胶质瘤细胞的增殖与侵袭机制,但目前尚未见缝隙连接磷酸化参与脑胶质瘤机制方面的研究报导。因此,本文意在开展Cx43磷酸化参与胶质瘤的机理的全新研究,初步探寻Cx43磷酸化是否与胶质瘤发生及其恶性程度存在某种相关性,并使用PKC、 PTK和MAPK等三种蛋白激酶抑制剂孵育细胞,探讨Cx43蛋白磷酸化在脑胶质瘤形成中各种可能的信号转导机制,研究Cx43蛋白磷酸化与缝隙连接细胞间通讯及脑胶质瘤的关系,争取能为胶质瘤的治疗研发新的思路,找到新的靶点。方法本研究分为三部分第一部分：Cx43蛋白在不同级别脑胶质瘤中磷酸化水平分析收集术中病理学诊断确诊的胶质瘤标本(WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级)作为实验组和脑外伤内减压术后收集的脑组织作为对照组。取胶质瘤组织作为实验组,正常组织作为对照组,分别切片,采用免疫组化技术检测实验组和对照组中组织中的Cx43磷酸化蛋白、Cx43蛋白的表达水平。同时利用Western blot技术检测实验组及对照组分组织中的Cx43磷酸化蛋白、Cx43蛋白的表达水平。比较分析在不同级别胶质瘤中的Cx43磷酸化蛋白、Cx43蛋白表达水平及相关性。不同级别胶质瘤组织中的Cx43、p-Cx43蛋白表达采用单因素方差分析,方差不齐时采用welch校正法。方差满足齐性条件时,两两比较采用LSD法,方差不齐时,方差分析采用Dunnett T3法。第二部分：PTK抑制剂、MAPK抑制剂和PKC抑制剂对胶质瘤细胞系U251细胞中Cx43蛋白磷酸化水平的影响有关心脏疾病的研究发现,GJ通道通过PKC、MAPK、PTK等途径磷酸化GJ蛋白进而GJ通道的功能受到影响；本研究在体外开展实验,为探明胶质瘤细胞在增殖中的信号转导机制,并研究清楚GJ蛋白的磷酸化水平是否存在PKC、MAPK、PTK等途径调节。本实验中,各种实验分析利用的是新复苏并且正常培养一周后的U251胶质瘤细胞。细胞分别用1μM PKC抑制剂(Staurosporine),0.5μM MAPK抑制剂(SB 203580)和50nM PTK抑制剂(Vatalanib 2HC1 PTK787)孵育12、24、48小时,为分析Cx43蛋白磷酸化在胶质瘤细胞信号通路中的作用,采用的是Western blot技术,并通过测定特异性抗体(如抗磷酸化S368的Cx43抗体、抗总蛋白Cx43抗体等)来检测GJ的磷酸化、总蛋白的表达水平。分析不同抑制剂在不同处理时间下对Cx43, p-Cx43总蛋白的影响,采用析因分析。分析时间及抑制剂的单独效应时,使用单因素方差分析,方差不齐时采用welch校正法。方差满足齐性条件时,两两比较采用LSD法,方差不齐时,方差分析采用DunnettT3法。第三部分：Cx43蛋白磷酸化对胶质瘤细胞U251增殖、侵袭和凋亡的影响细胞分别用1μM PKC抑制剂(Staurosporine)、0.5μM MAPK抑制剂(SB 203580)、50nM PTK抑制剂(Vatalanib 2HC1 PTK787)孵育12、24、48小时后,细胞活性的分析是采用MTT法,体外侵袭实验利用Transwell法,而细胞凋亡的检测采取TUNEL法。这样就可以了解胶质瘤细胞增殖、侵袭性及细胞凋亡与Cx43磷酸化水平之间的相关性。其中在分析不同抑制剂在不同处理时间下对细胞活性和transwell检测细胞侵袭能力的影响,采用析因分析。分析时间及抑制剂的单独效应时,使用单因素方差分析,方差不齐时采用welch校正法。方差满足齐性条件时,两两比较采用LSD法,方差不齐时,方差分析采用DunnettT3法。结果1.综合免疫组化与Western blot结果可以得出,在正常脑组织以及胶质瘤中的各部位组织均有Cx43蛋白的分布。同时,Cx43蛋白的表达水平与胶质瘤的级别相关,在WHOⅠ-Ⅱ级的低恶度胶质瘤组织中Cx43有较高的表达,而在WHO Ⅲ-Ⅳ的高恶度胶质瘤中有较低水平的Cx43表达,由此可见,Cx43表达水平和表达阳性率与肿瘤WHO分级有着明显负相关(P<0.01)。此外,p-Cx43的表达水平随胶质瘤的不同级别而有所不同,p-Cx43蛋白可在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织和正常组织中有表达,而p-Cx43蛋白在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组织中的存在则有明显增加(P<0.01),我们推测说明Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中p-Cx43表达量的增加与肿瘤恶性程度相关。2.分别应用PKC抑制剂(Staurosporine)、MAPK抑制剂(SB 203580)和PTK抑制剂(Vatalanib 2HC1 PTK787)孵育12、24、48小时后,发现三种抑制剂在12h和24 h对Cx43总蛋白量无明显影响(P>0.05),处理48h可显著降低Cx43的表达水平(P<0.01)。MAPK抑制剂(SB 203580)和PKC抑制剂(Staurosporine)孵育细胞12 h可显著抑制脑胶质瘤中P-Cx43-368蛋白的表达(P<0.01),MAPK抑制剂(SB 203580)和PKC抑制剂(Staurosporine)孵育48 h后可明显抑制脑胶质瘤中P-Cx43-368蛋白的表达(P<0.01)。3.MAPK抑制剂(SB 203580)孵育细胞12 h、24 h和48 h能显著降低U251细胞活性,增加细胞凋亡,抑制细胞侵袭(P<O.01)。PKC抑制剂(Staurosporine)孵育细胞12h、24h也能降低U251细胞活性(P<0.01),细胞侵袭能力受到抑制,增加细胞凋亡,但孵育细胞48 h后,检测发现细胞活性、凋亡和侵袭能力并没有明显改变。PTK抑制剂(Vatalanib 2HC1 PTK787))孵育细胞12 h、24 h和48 h对细胞活性、凋亡和侵袭均没有明显影响(P>0.05)。结论1、Cx43蛋白和p-Cx43蛋白在正常脑组织以及胶质瘤中的各部位组织均有表达。Cx43蛋白的表达量在不同级别的胶质瘤中的表达水平不同,Cx43表达水平和表达阳性率与肿瘤WHO分级有着明显负相关。p-Cx43表达量在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中增加与肿瘤恶性程度程正相关。2、MAPK、PKC等信号转导途径在胶质瘤细胞的增殖、侵袭性及细胞凋亡中有着重要作用,因为这些途径能影响GJ功能通过调节Cx43,总蛋白表达以及Cx43的磷酸化水平。PKC等信号转导途径的阻断会引起Cx43的Ser368过磷酸化的阻断,可以引起Cx43蛋白磷酸化的降低。Cx43蛋白磷酸化的降低增强GJ功能,使细胞侵袭能力和活性显著降低,增强细胞的凋亡能力,这为寻找有效治疗神经胶质瘤的手段开辟了一个全新的方法。