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人柯萨奇病毒B组2型(CV-B2)作为一个引起的儿童手足口病(HFMD)的病原体之一,流行病学研究证明CV-B2在人群中感染可能会引起重症病例,但相关的致病机理依然处于探索阶段,目前尚无针对CV-B2的有效药物或疫苗,因此建立合适的动物模型对于深入开展基础研究、疫苗研发与药物研究具有重要意义。本论文首先对CV-B2细胞基质及检测方法的建立进行摸索;之后选用与人类较为接近的非人灵长类动物(恒河猴)作为研究对象,构建CV-B2感染的动物模型,对感染模型临床表征、血液生化、排毒情况、组织病理学、细胞生物学及免疫学指标等进行初步研究,探索病毒与宿主之间不同层次的相互作用,为阐明病毒的感染机制、检测方法建立、灵长类动物模型评价等提供理论依据,以期为CV-B2后续开展其感染机制、疫苗研发、标准品构建及动物模型评价等提供数据支持。本研究第一部分建立CV-B2病毒培养体系及检测方法。方法将病毒接种于Vero细胞,按不同时间点收集病毒感染样品,采用微量滴定法测定病毒感染性滴度,绘制病毒感染Vero的增殖动力学曲线;用含有T7启动子的VP1基因与T载体连接后,经体外转录获得RNA标准品。利用标准品建立标准曲线,并对建立的方法进行灵敏度、特异性和重复性的评价。结果CV-B2在接种后3h后感染性滴度有小幅度的下降,9-18h滴度维持在106CCID50/ml左右,之后在24h达到最高滴度107 9CCID50/ml;q-RT-PCR检测结果显示建立的方法有较高的灵敏度、特异性和重复性。结论CV-B2可以感染Vero细胞,以MOI=0.01感染后24h可以收获较高的滴度;所建立的染料实时荧光定量法可快速和准确检测CV-B2病毒RNA样品的拷贝数。本研究第二部分主要探讨恒河猴作为CV-B2病毒感染动物模型的可行性。方法将CV-B2经消化道感染(口腔)方式,以106CCID50/100μl剂量感染3-4月龄的恒河猴,观察记录感染后临床症状;血液学常规检测;血清中生化指标、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、细胞因子及中和抗体效价进行检测;利用实时荧光定量PCR方法检测血液、咽拭子、粪便中的病毒载量和不同组织器官中的病毒分布,HE染色观察组织的病理变化,并通过免疫组织荧光和免疫组织化学技术检测CV-B2抗原;流式细胞检测外周血淋巴细胞的分群。结果病毒感染2天后恒河猴出现了类似人类手足口病的手、足、口的疱疹;动物出现精神沉郁、活动及饮食量减少等临床症状;血常规检测出病毒样改变;生化检测发现心肌酶、肝功、肾功发生了相应的改变;咽拭子、粪便、血液q-RT-PCR检测出现典型的排毒和病毒血症现象;组织病理学结果显示:CV-B2可导致恒河猴婴猴出现了手足口疱疹病理样改变,主要组织器官(大脑、心脏、咽、肾、肝等)呈现不同程度的病理改变;免疫荧光和免疫组化技术可在各组织中检测相应CV-B2抗原;免疫学检测发现感染前期IgA和IgM的升高;细胞因子一过性升高;淋巴细胞发生了相应的变化。结论本研究证实了 3-4个月的恒河猴婴猴可被CV-B2感染,主要表现为手足口病、病毒性脑炎、病毒性心肌炎、肝肾等多器官的损伤的病理样改变。同时,证实CV-B2病毒在感染恒河猴后可在体内复制、增殖和清除,该模型所有结果均反映了一个较为完整的病毒感染的过程,能够复制和再现相应模型的临床、病原、病理、免疫及实验室检测情况。