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植物的生长发育是由基因制控的,启动子是基因的一个重要组成部分,控制基因转录水平的表达,对其功能的研究成为基因表达调控研究的重要内容。根据基因的表达情况,启动子分为组成型、组织特异性型和诱导型三种类型。花药是植物的重要生殖器官之一,花粉的育性直接影响物种的繁衍和籽粒产量。分离鉴定花药特异表达基因及其启动子,有助于全面理解花药发育的分子调控机理,也为植物基因工程研究提供重要的调控元件,在利用基因工程手段创造雄性不育材料的杂种优势利用研究中有着良好的应用前景。 小麦是重要的粮食作物。本研究通过生物信息学分析结合分子生物学实验方法,筛选鉴定小麦花药特异表达基因及其启动子,取得主要研究结果如下: 1.利用核酸数据库dbEST中的数字化差异显示技术结合基因芯片数据,筛选出小麦花药特异性基因32个,基因注释表明大多数为未报道的新基因。随机选取10条基因EST序列设计引物,通过实时荧光定量PCR鉴定其在小麦颖片、外稃、内稃、花药、雌蕊、根、茎和叶片中的表达情况,结果表明8个基因为花药特异表达,其中2个基因仅在花药中表达,其余6个基因在其它个别组织中也有微量表达,但表达量远低于花药组织。Ta.69320的表达水平最高且仅在花药中表达,可能提供一个很好来源的花药特异高效表达的启动子。 2.根据Ta.69320的EST序列,通过cerealsdb小麦基因组数据库比对获得候选基因序列,经PCR克隆及测序验证,获得了该基因的全长序列,并命名为TaWA10。通过基因mRNA与预测蛋白质序列的BLAST分析,结果表明:该基因预测蛋白质序列与来自粗山羊草的一个功能未知的蛋白质序列完全一致,在乌拉尔图和大麦中也发现了其同源基因。蛋白质功能预测结果表明,该基因编码的蛋白含有具跨膜结构域的信号肽,在信号肽作用下经分泌途径运输到细胞膜上。 3.利用PlantCARE与PLACE软件分析小麦花药特异表达基因TaWA10的启动子序列,发现该启动子具有多个花药特异表达有关的顺式作用元件以及多种激素(脱落酸、茉莉酸甲酯、生长素和水杨酸)和胁迫响应的调控元件。4种花药特异表达元件为:GTGA(12个)、AGAAA(9个)、TGGGCY(4个)和AGGTCA(1个)。最后将该启动子序列连接GUS报告基因构建了植物表达载体,用于进一步的转基因功能验证。 4.利用PLACE与PlantCARE软件分析小麦花药特异表达基因TaRAFTIN1α的启动子序列,结果表明该启动子除含有TATA-box与CAAT-box等启动子基础元件外,还含有3种激素(脱落酸、茉莉酸甲酯和细胞分裂素)相关的调控元件,3种花药特异表达有关的作用元件:GTGA(4个)、AGAAA(4个)和TGGGCY(2个),以及胁迫响应有关的调控元件。根据生物信息学的分析结果,通过缺失法分别构建了包含1429bp、898bp和351bp不同长度启动子序列的融合GUS报告基因植物表达载体,为进一步转基因验证启动子的表达特征及其核心序列提供必要的实验材料。