论文部分内容阅读
目的:传统中医理论认为脾气虚可导致肝在内的五脏不安,又指出脾虚易为肝乘,表明肝能够耐受脾气虚的干扰而不改变其克脾的属性,其现代医学机制不明。线粒体是机体细胞进行有氧呼吸和能量生成的主要场所,为肝脏各种功能活动提供能量。本研究主要围绕肝细胞线粒体的结构和功能及其蛋白质控等,初步探讨肝耐受脾气虚的可能机制。材料与方法:1.实验动物16只SPF级SD雄鼠,每只体重在190～210克之间,鼠龄7周左右。根据随机数字表法进行分组,共分成两组即正常组（对照组）8只和脾气虚证组（模型组）8只,适应性饲养1周之后进行实验。2.脾气虚证模型复制及其评价2.1模型复制15天内对实验组大鼠进行5个循环的饥饿失常刺激（即饱食1 d+禁食不禁水2 d）并且每天在温度30～35℃的水里游泳直至力竭。2.2模型评价当模型组大鼠出现消瘦、食少、乏力、神疲、毛色枯槁等情况时为造模成功。3.取材使要解剖的大鼠空腹12h以上,使大鼠麻醉。剖开腹部后,先进行腹主动脉采血,后断头处死大鼠,于冰上取肝脏组织,切取为1mm×1mm×1mm的小块肝组织于2.5%的戊二醛中固定,其余肝组织存放在-80℃的设备内冻存备用,对血液进行离心后吸出上清液冻存于-80℃设备内备用。4.肝细胞线粒体的形态学观察取固定于2.5%戊二醛中的1mm3肝组织,进行PBS漂洗,1%的锇酸固定,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋聚合,切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染。处理后的标本用透射电镜观察肝脏的线粒体形态并拍照记录。5.肝脏功能检测5.1血清中谷草转氨酶（GOT）的活性检测在GOT的催化作用下,α-酮戊二酸和天门冬氨酸能发生转氨基的反应,生成谷氨酸及草酰乙酸,后者进一步脱羧生成了丙酮酸;丙酮酸能够和2,4-二硝基苯肼进行反应而生成2,4-二硝基苯腙,其在碱性的条件下显棕红色,根据在505nm的吸光度变化来计算GOT的活力。5.2血清中谷丙转氨酶（GPT）的活性检测GPT能催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基的反应,从而生成丙酮酸与谷氨酸;再加2,4-二硝基苯肼,以此来终止反应,并且与酮酸中的羰基加成,生成丙酮酸苯腙;其在碱性的条件下呈现红棕色,可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。5.3肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的检测SOD能催化超氧化物的阴离子发生歧化反应,进而生成H2O2和O2。它通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶的的反应系统产生超氧阴离子（O2-）,能够还原氮蓝四唑而生成蓝色的甲臜,后者在560nm处能够检测出来;SOD可清除超氧阴离子,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深则说明SOD的活性越低,反之活性则越高。5.4肝组织中丙二醛（MDA）活性的检测当氧自由基作用在脂质的不饱和脂肪酸时,便能生成过氧化脂质;后者逐渐分解成一系列复杂的化合物,其中包括丙二醛。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化水平。6.肝细胞线粒体三磷酸腺苷（ATP）和膜电位（MMP）水平的检测按照试剂盒说明书的操作提取肝脏线粒体并制备肝脏组织匀浆,取处理后的上清液进行实验,用比色的方法来检测肝脏线粒体中ATP的含量,用JC-1的检测法来检测肝脏线粒体膜电位的变化。7.肝细胞线粒体蛋白质控（MPQC）相关蛋白表达用冻存于-80℃的肝脏组织进行总蛋白的提取,运用蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）,检测热休克蛋白70（hot shock protein 70,Hsp70）、Lon蛋白酶（Lon protease,Lon P）及酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease,Clp）XP复合物（包括Clp X和Clp P）等蛋白的表达。8.数据处理采用SPSS17.0统计软件,数据用均值±标准差（X±S）的方式表示,采用t检验,P<0.05时被认为具有统计学意义。结果:1.模型复制与评价与对照组比较,脾气虚证大鼠的体质量、饮水量及进食量、前肢抓力、运动距离、站立次数都明显减少,并且模型组大鼠的被毛与正常组相比枯槁无光,易脱落。因此,可视为模型复制成功。2.肝细胞线粒体的形态学变化正常组和模型组大鼠肝脏细胞中线粒体均大量的分布于细胞核的附近,结构形态相似,均呈卵圆形,边缘清楚,内部致密,未见到明显异常变化。3.肝脏功能损伤评价正常组与模型组血清中的GOT活性分别为3.33±0.46 U/ml、4.09±0.68 U/ml（n=8,P<0.05）;血清中的GPT活性分别为0.86±0.63 U/ml、1.95±0.46U/ml（n=8,P<0.05）;正常组与模型组肝脏组织中的SOD值分别为24728.02±3746.94U/g、11546.58±1460.72 U/g（n=8,P<0.01）;肝组织中的MDA值分别为33.53±4.24nmol/g、40.04±1.76 nmol/g（n=8,P<0.05）。4.肝细胞线粒体ATP和MMP水平变化正常组与模型组肝组织ATP含量分别为1.290±0.186 pmol/mg、0.698±0.132 pmol/mg（n=8,P<0.01）;两组的肝细胞线粒体膜电位分别为1.158±0.195 A.U.、0.526±0.141 A.U.（n=8,P<0.01）。5.肝细胞MPQC相关蛋白表达正常组与模型组Hsp70表达分别为0.599±0.048和0.966±0.035（n=8,P<0.01）;Lon P表达为1.020±0.087和0.730±0.080（n=8,P<0.01）;Clp X表达为0.836±0.090和1.147±0.113（n=8,P<0.01）;Clp P表达为0.940±0.024和1.288±0.120（n=8,P<0.01）。结论:1.脾气虚时肝细胞线粒体功能出现了一定损伤,但同时肝细胞的MPQC作用增强,从而对抗脾气虚所造成的干扰。因此,本研究认为肝耐受脾气虚的机制与肝细胞MPQC增强有关。