恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。目前认为恶性肿瘤的发生是一个多阶段的过程，从正常细胞、癌前病变、原位癌到恶性肿瘤的侵袭和转移，细胞内发生了许多基因和蛋白水平的变化，最终导致明显的形态和生物学行为改变。细胞癌变决定于多种因素的综合作用，如原癌基因的激活，编码的生长因子类和／或受体类活性蛋白过度表达，抑癌基因的突变或缺失，导致其功能丧失等。另外某些因子的表达改变，会引起信号传导异常，进而导致相关基因表达调节失控，最终导致细胞增殖和分化障碍或异常，形成肿瘤。 许多种类的生长因子都与细胞的增殖和分化及其它生物学行为密切相关，肝细胞生长因子／扩散因子(hepatocyte growth factor／scatter factor，HGF／SF)是成纤维细胞来源的生长因子，其复杂的生物学功能是通过跨膜的酪氨酸型激酶表面受体原癌基因c-met蛋白发挥作用，可促进细胞分裂、上皮细胞迁移、运动及新生血管形成，在肿瘤的形成、肿瘤细胞的浸润和转移、分化及肿瘤血管形成过程中发挥重要的作用。机体内肝细胞生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator，HGFA)属于丝氨酸蛋白酶类，可激活HGF／SF前体，使之从单链前体变为双链活性形式，是调节细胞外HGF／SF活性的关键步骤。HGFA主要由肝细胞分泌，在血中以无活性的酶原形式存在。组织损伤时，可能由凝血酶在损伤组织局部通过蛋白水解激活HGFA。1997年首先在胃癌细胞系MKN45的无血清培养基中分离、纯化并鉴定的肝细胞生长因子激活因子的抑制因子(hepatocyte growth factor activator inhibitor，HAI)，为一类新的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子，可特异性地抑制HGFA。由于血清中的其它蛋白酶抑制因子均不能抑制HGFA的活性，因此局部合成的HAI(包括HAI-1、HAI-2)在调节HGFA的活性以及由此影响的HGF／SF的活性中，可能发挥重要的作用。 本课题从与肿瘤发生、发展密切相关的HGF-c-Met介导的信号传导系统上游 浙江大学硕士研究生论文 调节因子HAll出发，构建HAI1的原核细胞GST融合蛋白表达载体，回收表达 的融合蛋白作为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术制备单克隆抗体，用免疫组织化学 方法检测HAll在正常组织和肿瘤组织中的表达情况，并分析了HAll在大肠癌 组织及癌旁（正常）组织中的表达差异，探讨在大肠癌的发生和发展中HAll可 能发挥的作用及作用途径。 1．HAll基因的原核表达及蛋白纯化：用限制性内切酶酶切、T． DNA连接酶 连接、分段重组构建 pGEX－SX－2－HA！－l（ECOR＋BOmH）和 PGEX－SX－IHAI l（EcoR＋Xho）原核表达质粒。以双酶切鉴定阳性克隆质粒，转化 P2392 E。。h 菌，IPTG诱导表达GST．HAll 融合蛋白，以SDS－PAGE验证表达融合蛋白。 GST－HAll融合蛋白主要存在于不溶性包涵体沉淀中，经制各型SDS－PAGE电泳 后割胶、电洗脱回收融合蛋白，PBS中透析24小时，冷冻干燥后重溶在PBS中， 以BSA标准品测定融合蛋白浓度，20℃冻存备用。 2 HAll 蛋白单克隆抗体的制备：用纯化的原核表达的GST．HAll 融合蛋 白免疫BALB汇小鼠，应用杂交瘤技术，经细胞融合，筛选，克隆化培养，并制 备腹水，获得含HAll单克隆抗体ZMC6的小鼠腹水，ELISA测定ZMC6腹水效 价为 1：262，144，Western Blot证实该单抗具有较好的特异性，可用于免疫组化方 法检测组织表达的HAll蛋白。 3．HAll蛋白的组织表达分布：以HAll作免疫组化检测HAll蛋白 在正常及肿瘤组织的表达，分别检测人胃、十二指肠、大肠、肺、支气管、乳腺、 甲状腺及于宫内膜等正常组织及相应的肿瘤组织，可见HAll i白在胃、大肠轴 膜表面的上皮细胞基底、侧面细胞膜上呈强阳性，乳腺癌细胞膜呈强阳性，细胞 浆亦为阳性。结果还显示在检测的各种上皮组织和相应的肿瘤组织中有HAll 蛋 白不同程度表达，其中正常胃、大肠郭膜的上皮细胞呈强阳性，而腺体基本呈阴 性或弱阳性，大肠癌组织呈阳性；乳腺正常导管上皮细胞呈阴性或弱阳性，乳腺 癌细胞呈强阳性。正常甲状腺呈阴性，甲状腺癌呈强阳性；支气管上皮细胞呈阳 性，肺泡上皮细胞呈阳性，肺鳞癌细胞呈阳性：脑膜瘤细胞呈阴性；食道复层鳞 状上皮呈阴性，食道鳞癌呈阳性，食道腺癌呈阳性：子宫内膜及腺体、于宫内膜 癌均呈阳性。 4．大肠癌组织中HAll 的表达与临床病理的相关性分析：应用免疫组化检 测HAll 在人肠癌及癌旁（正常）组织中的表达，结果表明大肠虱膜表面上皮细 2 浙江大学硕?