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油茶Camellia oleifera C.Abel,属于山茶科（Theaceae）,山茶属（Camellia）,是南方主要的经济树种之一,近年来,随着政府的大力扶持,油茶产业逐渐发展起来,但是油茶产量由于受到天气,季节和病害,虫害等原因,导致结果率低,产量差,制约着油茶产业的发展。目前对油茶的病害研究多集中细菌病害和真菌病害,对油茶病毒病害的研究较少。为此,本研究采用二代转录组测序的方法,对江西省萍乡市芦溪县部分油茶样本进行了研究,测序结果进行生物信息学分析后,结合分子生物学和传统生物学方法对样本中的病毒序列进行验证、鉴定与检测,主要内容如下:（1）分别于2017年10月,2018年3月及2018年6月不同时间段采集江西省萍乡市芦溪县不同品种的油茶树的叶片,品种为赣无2号,长林3号,长林4号,长林40号。叶片的症状为褪绿、黄化、坏死、枯斑、无症状等。选取2018年6月采集的其中15个不同的油茶叶片样品分成3组编号为COX1、COX2、COX3后,每大组有5个小样本等量混合并研磨成粉末,送公司进行转录组测序,测序结果利用CLC Genomics Workbench 9.5.2进行生物信息学分析,结果表明COX-1、COX-2和COX-3每个分别有147685916、161177150及151010940个Reads,分别产生228,266、75,314及152,609个拼接Contigs（>200 nt）。把这些拼接与NCBI中病毒序列比对后发现COX-1中与植物病毒序列具有部分同源的有COX-1contig9201,其全长为3910nt,其中一个ORF（Open Reading Frame）与Tombusviridae科中的Machlomovirus成员甜瓜坏死斑点病毒（Melon n ecrotic spot virus,MNSV）有45.05%的同源性。COX2中与植物病毒序列具有部分同源性的有COX2contig2097,长度为1290nt,与Partiviridae科中Parti virus成员萝卜潜隐病毒（Raphanus sativus cryptic virus 2,RSCV2）的氨基酸同源性（70%）,而COX2contig1002中获得的序列有1487nt,与DeltaPartivirus成员草莓潜隐病毒（Fragaria chiloensis cryptic virus,FCCV）的RNA依赖的RNA聚合酶的氨基酸同源性为39%,COX2contig1193中获得的序列有1328nt,与DeltaPartivirus成员（Raphanus sativus cryptic virus 2,RSCV2）的氨基酸同源性为36%。而COX2contig7中获得的序列4732nt,与Totiviridae科中Totivirus成员（Maize associated totivirus 3,MaTV-3）的氨基酸同源性为38%;油茶双生病毒含有两个环状的DNA链,一个为A链,另一个为B链,COX2contig31702中获得的1138nt序列与Geminiviridae科中Begomovirus成员Whitefly associated begomovirus2的A链的复制相关蛋白的氨基酸同源性60%。COX2contig7447中获得的284nt与Caulimoviridae科中Badnavirus成员（Citrus yellow mosaic virus,CYMV）的氨基酸同源性为51%,COX2contig39455中获得的455nt序列与Caulimoviridae科中Badnavirus成员Piper DNA virus 1的氨基酸同源性为67%。而COX3contig44215获得的2807nt序列与Geminiviridae科Begomoviru s成员（Tomato leaf curl virus,TLCuV）的A链的核苷酸同源性66.86%,覆盖度为43%。COX3-contig17629中有581nt与Geminiviridae科Begomovirus成员（Soy bean chlorotic blotch virus,SbCBV）的B链的氨基酸同源性40.85%,覆盖度为74%。在COX2,COX3的病毒序列中均含有Begomovirus病毒。（2）以COX2contig2097,COX2contig1002,及COX2contig1193分别为模板设计引物,利用RT-PCR和RACE技术对三段序列进行克隆。测序后获得的全序列长分别为1712nt（RNA1）、1504nt（RNA2）、1353nt（RNA3）。其中R NA1有一个ORF,预测编码的蛋白为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA depende nt RNA polymerase）RDRP,含477个氨基酸,分子量约为52.74kDa。RNA2经过预测后含有343个氨基酸,分子量为40.74kDa,而RNA3含有344个氨基酸,分子量为40.59kDa,其基因组结构特征与Deltapartivirus成员类似,且与萝卜潜隐病毒（Raphanus sativus cryptic virus 2,RSCV 2）的RNA1核苷酸同源性最高为62.88%,因此该病毒序列可能是Deltapartivirus成员,且根据国际病毒分类委员会（ICTV）中新种标准,即编码RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）的氨基酸同源性低于70%,核苷酸低于80%,确认该病毒为新种,暂命名为Oil tea associated Deltapartivirus（OTaDV）,Genebank序列号为dsRNA1（MH814756）、d sRNA2（MH814757）、dsRNA3（MH814758）。Deltapartivirus是一种双链RNA病毒,主要侵染植物,叶片多无症状,表现为隐性,浓度较低,可以通过种子和花粉进行传播病毒,是一种持续性侵染方式的病毒。对采集的不同季节的73份油茶样品进行田间检测,采用RT-PCR的方法进行,选用一对特异性引物（F-AG AGTCTATGAAGTCCCTCAACTC;R-TTGGTACCTTCTGGGTAGAC）,预期目的片段为751nt,一共有5份样品有目的条带,经过测序验证是OTaDV,检出率为6.8%,证明了油茶确实存在这个病毒。对已经成功检测出的病毒样品进行指示植物鉴定,采用烟草和苋色藜作为寄主,进行摩擦接种,OTaDV病毒没有在指示植物中检测到。（3）以COX3contig44215为模板设计引物进行PCR扩增,获得了一条长为3232nt的序列,ORF预测后,含有5个ORF,分别为AV1、AC1、AC2、AC3和AC4。AV1的长度为711nt,编码的外壳蛋白（CP）,氨基酸个数为236个,分子量为26.93kDa;AC1的长度为1011nt,编码的是复制相关蛋白Rep,氨基酸个数为366个,分子量为41.39kDa;AC2的长度是366nt,编码复制转录激活蛋白TrAP,氨基酸个数为121个,蛋白质的分子量为13.75kDa;AC3的长度为408nt,主要是编码复制增强蛋白REn,氨基酸个数为135个,分子量为16kDa,AC4的长度是387nt,氨基酸个数为128个,分子量为14.38kDa。油茶双生病毒A链核酸同源性与一品红黄化叶卷曲病毒Euphorbia yellow leaf curl vir us最高（52.50%）,而B链是COX-3contig17629为模板,采用PCR及滚环扩增（RCA）的方法进行扩增,获得了3059nt,B链中BV1的长度为612nt,编码核穿梭蛋白NSP,氨基酸个数为203个,分子量为22.91kDa;BC1的长度为963nt,编码移动蛋白MP,氨基酸个数为320个,分子量为35.13kDa。同源比对后发现B链核苷酸同源性与醉蝶花叶皱缩病毒Cleome leaf crumple virus的同源性最高为37.36%。系统进化分析表明:油茶双生病毒B链与双生病毒科未归类属的病毒聚为一类,与A链的系统发育树一致,证明是一种新的双生病毒科,未归类的新病毒。根据国际病毒分类委员会（ICTV）对Geminividae中新种的规定（aa<70%,nt<90%）,暂时命名为Oil tea associated Geminivirus（OTaGV）。双生病毒是一种单链环状DNA病毒,主要侵染双子叶植物和单子叶植物,叶片表现出黄化,坏死,褪绿等症状,影响光合作用,导致农作物减产,但是双生病毒可以用来构建表达载体,表达外源的蛋白质,减轻病毒症状。对采集的30份油茶样品进行田间检测,采用PCR的方法,一共有28份样品为阳性克隆,经过测序验证,测序的结果与原序列同源性达100%,计算油茶双生病毒检出率为93.33%,证明了油茶确实存在该病毒,同时也在山茶中进行了筛查,10个样本中有8个样本含有油茶双生病毒,证明了油茶双生病毒的广泛存在,油茶双生病毒检出率为80%。采用带毒的油茶种子进行播种,取4叶带毒的油茶小苗进行总核酸提取,PCR验证,有阳性克隆片段,经过分子克隆后,测序验证后,测得序列与原序列同源性为100%,证明该病毒是以种子进行传播。（4）本论文首次对国内江西省萍乡市芦溪县部分油茶样本进行了病毒病检测,鉴定了两种油茶新病毒,分析了油茶新病毒的分子特征,本研究的结果为我国油茶病毒病害的流行和传播奠定了基础,为防治油茶病毒病害的发生提供一定的参考价值。同时这也丰富了木本病毒资源库,为开发木本病毒表达载体提供理论依据。