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【背景及目的】胆管异常增生是胆汁淤积性肝纤维化发生的关键病理学基础,Notch信号通路在这一过程中发挥关键作用。Numb基因是Notch信号的负调节因子。课题组前期研究结果表明,黄芪汤（Huangqi Decoction,HQD）可有效抑制胆管结扎（bile duct ligation,BDL）诱导的胆汁性肝纤维化的进展,其作用机制与抑制Notch信号通路的活化有关,并发现模型大鼠肝组织Numb的表达水平显著降低,而黄芪汤可显著提高Numb的表达。但Numb基因是否在胆汁性肝纤维化的发生与发展中发挥关键作用,及其是否为黄芪汤抗胆汁性性肝纤维化的关键作用靶点,目前尚不清楚。因此,本研究旨在明确Numb基因与胆汁性肝纤维化发生发展的关系,及其对黄芪汤抗胆汁性肝纤维化作用的影响。【方法】1、全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）。纯化并培养至第三代后,使用流式细胞仪检测细胞的CD10、CD14、CD29、CD34、CD45、CD90的表达水平以鉴定细胞纯度,检测BMSCs的细胞周期,并诱导其成骨、成脂分化以确定其生物学特性。2、BMSC Numb基因敲减（knockdown,Numb-KD）和BMSC Numb基因过表达（Numb-overexpression,Numb-OE）。使用慢病毒转染技术敲减和过表达BMSC的Numb基因,同时设立空载病毒体组作阴性对照（Negative control,NC-KD,NC-OE）,对每组细胞进行转染,观察细胞形态以及病毒转染率。提取细胞RNA,通过RT-PCR实验确定Numb基因敲减或过表达成功。转染成功的BMSC自带增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）。3、胆汁淤积性肝纤维化模型建立及BMSCs移植。采用胆总管结扎方法制备大鼠胆汁性肝纤维化模型,同时将BMSC,BMSCNC-KD,BMSCNumb-KD,BMSCNC-OE及BMSCNumb-OE细胞按分组进行脾脏注射,每只大鼠注射细胞量为1×106cells。造模4周后处死取材,观察大鼠血清肝功能、肝组织病理、肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量变化及α-SMA、CK7、CK19、HNF4α和Alb的表达。4、Numb基因敲减和Numb基因过表达对黄芪汤抗胆汁性肝纤维化作用的影响。大鼠胆总管结扎并脾脏移植BMSCNumb-KD,BMSCNumb-OE细胞,一周后开始予以黄芪汤灌胃,并以DAPT（γ-seacretase抑制剂）作为阳性对照药物,共干预3周。造模4周末取材,观察大鼠血清肝功能、肝组织病理及肝组织羟脯氨酸含量变化。免疫组织化学染色观察肝组织α-SMA、CK7和CK19的表达;通过Western blot和RT-PCR观察肝组织α-SMA、CK7、CK19、Numb以及Notch信号通路关键分子的蛋白和m RNA表达水平。5、通过免疫共染实验观察移植的BMSCNumb-KD和BMSCNumb-OE的分化取向。【结果】1、分离的大鼠BMSC细胞形态上符合长梭形、呈旋涡状生长的形态特征。流式细胞仪鉴定结果为CD10（-）、CD14（-）、CD34（-）、CD45（-）、CD29（+）、CD90（+）。成脂诱导后BMSC出现大量脂粒,成骨诱导后BMSC出现大量的钙盐沉积。细胞周期结果显示80.20%的BMSC处于G1期,表明所分离的BMSC具有较理想的分化能力。在MOI=80时,慢病毒转染细胞率达到80%以上。RT-PCR结果显示,与相应的对照组相比,Numb-OE组的Numb表达显著升高（P<0.01）,Numb-KD组的Numb表达显著降低（P<0.01）。2、肝组织Hyp检测结果显示,与Sham组相比,BDL组大鼠的肝组织Hyp含量显著增加（P<0.01）。与BDL组比较,BMSC组肝组织Hyp含量显著降低（P<0.05）;与BMSCNC-KD组相比,BMSCNumb-KD组肝组织Hyp含量明显提高（P<0.01）。与BMSCNC-OE组相比,BMSCNumb-OE组肝组织Hyp含量明显减轻（P<0.01）。3、HE染色结果显示,BDL组可见广泛胆管增生,炎性细胞浸润及组织坏死较少。BMSC组较BDL组肝脏胆管增生和炎症浸润明显减轻。BMSCNumb-KD组较BMSCNC-KD组胆管增生和炎症浸润加重,BMSCNumb-OE组较BMSCNC-OE组肝脏胆管增生和炎症浸润明显减轻。天狼猩红染色结果显示,BDL组大鼠肝内新生胆管周围有大量胶原沉积,并以汇管区为中心向肝实质内延伸。与BDL组比较,BMSC组肝组织内胶原沉积明显减轻。BMSCNumb-KD组较BMSCNC-KD组肝脏胶原沉积加重,BMSCNumb-OE组较BMSCNC-OE组肝脏胶原沉积明显减轻。4、免疫组化染色结果显示,与BDL组相比,BMSC组的α-SMA,CK7和CK19的表达显著减少,HNF4α和Alb的表达显著增加。与BMSCNC-KD组相比,BMSCNumb-KD组α-SMA,CK7和CK19的表达明显增加。与BMSCNumb-KD组相比,HQD+BMSCNumb-KD组的CK7和CK19的表达无明显改变。与BMSCNC-OE组相比,BMSCNumb-OE组α-SMA,CK7和CK19的表达明显减少,HNF4α和Alb的表达显著增加。与BMSCNumb-OE组相比,HQD+BMSCNumb-OE组α-SMA,CK7和CK19的表达无明显改变。α-SMA和CK19的蛋白与m RNA结果表现出相似的趋势。5、免疫共染结果显示:BMSCNumb-KD移植组可见EGFP/CK7和EGFP/CK19大量共染,提示Numb基因敲减可促使BMSC向胆管上皮细胞分化;HQD+BMSCNumb-KD移植组也出现EGFP/CK7和EGFP/CK19大量共染,表明HQD并不能抑制BMSCNumb-KD向胆管上皮细胞分化。BMSCNumb-OE移植组可见EGFP/HNF4α和EGFP/Alb大量共染,提示Numb基因过表达可促使BMSC向肝细胞分化。6、Notch信号通路RT-PCR结果显示:与BDL组相比,HQD组Numb m RNA表达显著提高（P<0.05）,RBPjκ和Hes1 m RNA显著下降（P<0.01）;与BMSCNC-KD组比较,BMSCNumb-KD组Numb m RNA表达显著降低（P<0.01）,RBPjκ和Hes1m RNA显著升高（P<0.01）;与BMSCNumb-KD组相比,HQD+BMSCNumb-KD组的RBPjκ和Hes1 m RNA无明显改变。与BMSCNC-OE组比较,BMSCNumb-OE组Numb m RNA表达提高（P<0.05）,RBPjκ和Hes1m RNA显著下降（P<0.05）;与BMSCNumb-OE组相比,HQD+BMSCNumb-OE组的Numb,RBPjκ和Hes1 m RNA无明显改变。相关蛋白表达呈现了相似的趋势。【结论】1.Numb基因敲减后可以促进胆汁性肝纤维化进展,而Numb基因过表达可抑制胆汁性肝纤维化进展,表明Numb基因在胆汁性肝纤维化的发展中起重要作用;2.BMSCs Numb基因敲减后移植可使黄芪汤抗胆汁性肝纤维化的作用明显减弱,可能与Numb敲减后黄芪汤抑制Notch信号的作用减弱有关,表明该基因可能是黄芪汤抗胆汁性肝纤维化的有效作用靶点之一。