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丙二酰辅酶A(Malonyl-coenzymeA)是多种生物能源、生物基化合物的关键前体物质,例如脂肪酸类化合物,也是许多医药类天然产物合成的非常重要的前体物质,比如黄酮类化合物,聚酮类化合物等。丙二酰辅酶A下游产物在医药,保健品,化工领域及生物燃料等多个领域具有重要的应用价值。因此构建高产丙二酰辅酶A平台菌株对于其下游化合物的合成非常重要。酿酒酵母的遗传背景清晰,安全性高,耐受性好,基因操作及改造手段成熟,是极具潜力的微生物细胞工厂,因此有必要构建丙二酰辅酶A的平台菌株,用于下游产品的合成。目前针对该前体的研究主要集中在通过理性的手段调控丙二酰辅酶A合成,如加强丙二酰辅酶A合成的上游途径,增强丙二酰辅酶A的供应,弱化磷脂等下游代谢途径,降低丙二酰辅酶A的消耗等,但其代谢通量依然较低,因此迫切需要在理性改造的基础上,通过非理性突变结合高通量筛选技术,寻找新的进一步提高其合成的关键靶点。人工合成酵母基因组(Synthetic yeast genome project,也称 Sc2.0 Project)菌株是一种高度修饰的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组,其在非必需基因3’端终止密码子TAA下游插入loxPsym(基因重组位点),可通过基因组重排系统(Rearrangement and modification by loxp-mediated evolution,简称SCRaMbLE),实现快速基因组重排和进化,获得有重要应用潜力的菌株。本论文在课题组前期在酿酒酵母中构建的丙二酰辅酶A生物传感器的基础上,利用合成染色体酿酒酵母菌株(SynV)通过SCRaMbLE技术进行基因组重排,快速获得突变体库,结合流式细胞分选高通量筛选高丙二酰辅酶A合成菌株。首先在合成染色体酿酒酵母菌株(SynV)中引入丙二酰辅酶A生物传感器,利用β-雌二醇诱导基因组重排。在此基础上,通过流式分选、酶标仪筛选荧光提高的突变体;再在突变菌株中引入3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,简称3-HP)合成途径,通过3-HP的产量确定筛选效果。经过多轮的流式细胞仪分选,从一百多万细胞中筛出2万多个细胞。再在实验室酶标仪复筛,最终筛选获得一株高产突变体,利用丙二酰辅酶A生物传感器测定,荧光值相比于野生型提高283%,3-HP的产量提高116.4%,产量达到101.5mg/L。在非理性筛选的同时,通过理性改造,提高丙二酰辅酶A的合成,在超表达乙酰辅酶A羧化酶的菌株中,通过引入柠檬酸裂解酶途径合成乙酰辅酶A,并增强细胞质柠檬酸的积累,弱化三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,简称TCA)代谢通路等策略,提高丙二酰辅酶A的合成,其中敲除异柠檬酸裂解酶(Isocitrate lyase,简称ICL1)基因或同时敲除异柠檬酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶(Isocitrate dehydrogenase,简称IDH1)基因,分别使荧光相比于野生型菌株提高51 9.4%和359.4%,提高效果最为明显。本研究利用丙二酰辅酶A生物传感器结合SCRaMbLE技术筛选高丙二酰辅酶A突变菌株。后续将对高产突变体进行全基因组测序,获得影响丙二酰辅酶A代谢的新型关键靶点,用于理性改造,以进一步提高重要下游产物的产量。