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背景大量的动物实验结果和临床证据证实,醛固酮能够加重心肌缺血和心肌损伤、诱导心肌细胞凋亡和坏死；促进心肌、血管细胞外基质的沉积和内皮功能障碍；加速冠心病、急性心肌梗死后的心室重构和心力衰竭。醛固酮是影响心血管疾病发生、发展和转归的独立的危险因素。醛固酮和急性心肌梗死引起的心室重构和心力衰竭已成为心血管疾病事件链的研究热点和重点之一,但醛固酮诱导急性心肌梗死后心室重构的机制仍未完全明了。醛固酮诱导急性心肌梗死后心室重构的机制与P38MAPK密切相关,P38MAPK抑制剂能够抑制醛固酮引起的心肌细胞凋亡、心肌肥厚和心肌纤维化,改善心梗后心脏功能障碍和心脏病理性重构。但是目前缺乏针对P38MAPK激酶的特异性抑制剂。小剂量P38MAPK抑制剂效果较差,而高浓度抑制剂会抑制其他激酶的活性,而且P38MAPK抑制剂仅仅在配体和受体的水平上起作用,而不能完全从基因水平来揭示其机理。RNA干扰(RNA i)技术是一种有效的基因沉默手段,能够高效、特异地抑制特定基因的表达。因此,通过P38MAPK基因沉默方法就可以更进一步探讨P38MAPK信号通路在醛固酮过负荷心梗后心室重构中的作用及机制。目的探讨慢病毒介导的P38MAPK RNAi在醛固酮过负荷心梗后心室重构中的作用,更进一步阐释醛固酮过负荷在心梗后心室重构中的基因、分子和整体的机制。方法实验一：在GeneBank中查找到大鼠P38MAPK基因序列,通过RNAi软件设计3个shRNA片段序列,将shRNA模板退火,并将pGPU6/GFP/Neo载体线性化,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒(pGsh)并测序鉴定。用AngⅡ(1μM)刺激24小时来建立H9C-2心肌细胞肥大模型,实验共分为6组,分别为心肌细胞对照组；AngⅡ组；AngⅡ+pGsh1组;AngⅡ+pGsh2组；AngⅡ+pGsh3组和AngⅡ+pGsh阴性组。用免疫荧光形态学检测pGsh的转染效率,RT-PCR检测P38MAPK mRNA表达水平,western blot检测磷酸化P38MAPK蛋白表达水平,筛选出最有效的pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒。进一步构建U6启动子的慢病毒载体,利用磷酸钙法共转染三质粒,制备P38MAPK shRNA慢病毒载体(PGLV-shRNA),并经过测序成功鉴定。实验二：用醛固酮(Aldo10nM)刺激24小时,诱导建立H9C-2心肌细胞凋亡模型。实验分为6组：分别为心肌细胞对照组；Aldo组；Ald+PGLV-shRNA1组；Aldo+PGLV-shRNA2组;Aldo+PGLV-shRNA3组和Aldo+PGLV-shRNA阴性组。H9C-2心肌细胞的凋亡运用TdT介导的dUTP缺口末端标记方法来检测,用实时定量PCR和western blot检测P38MAPKmRNA表达水平和磷酸化P38MAPK蛋白水平。原代培养新生大鼠心肌成纤维细胞,用转化生长因子β(TGF-β4nM)刺激24小时建立心肌纤维化模型。实验分为4组：分别为心肌细胞对照组；TGF-β组；TGF-β+PGLV-shRNA3组和TGF-β+PGLV-shRNA阴性组。采用实时定量PCR检测P38MAPK、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达水平。western blot检测CTGF和a-SMA蛋白水平。实验三：选取体重250-300g的雄性SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支,制作大鼠急性心肌梗死模型。术前1天至术后28天鼻饲醛固酮(1mg/kg/d), PGLV-shRNA经尾静脉注射(2×108IU/周),时间为术后1周至术后4周。分为3组(n=6):PGLV-shRNA组；PGLV-shRNA阴性组和假手术组。手术后第1、4周应用心脏超声检测评价各组大鼠的心功能。TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Masson染色评价胶原容积分数。采用实时定量PCR检测P38MAPK、CTGF mRNA表达水平,western blot检测CTGF和a-SMA蛋白水平。结果免疫荧光结果显示,在脂质体的介导下,pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒(pGsh)转染后进入H9C-2心肌细胞,转染后第24h,可见GFP标记的shRNA分布在心肌细胞的胞浆及细胞核中,转染效率达70%。AngⅡ各实验组相比,pGshl、 pGsh2和pGsh3组的P38MAPK mRNA和磷酸化蛋白的水平明显降低(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。说明构建的P38MAPK shRNA质粒均可显著抑制P38MAPK目的基因的表达,且针对第1097碱基的pGsh3质粒效果最好。醛固酮(10nM)刺激24小时使凋亡的心肌细胞显著增加2.8倍。醛固酮各实验组相比,PGLV-shRNA2, PGLV-shRNA3明显下调了醛固酮诱导的心肌细胞凋亡,明显下调了P38MAPK mRNA和磷酸化P38MAPK蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。心肌细胞各实验组相比,TGF-β使心肌成纤维细胞P38MAPK、CTGF mRNA表达显著增加(P<0.01,P<0.01),使磷酸化P38MAPK蛋白、CTGF蛋白和a-SMA蛋白表达显著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。PGLV-shRNA3明显下调TGF-β所诱导心肌成纤维细胞P38MAPK mRNA、CTGF mRNA、磷酸化P38MAPK蛋白、CTGF蛋白和α-SMA蛋白表达(P all<0.01)。心梗术后第1周,可见心脏的收缩功能明显下降,短轴缩短率(FS)下降,左室射血分数减退(LVEF<50%)。心梗组FS、LVEF与假手术组相比有显著降低(P<0.01,P<0.01),同时伴有左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)显著扩大(P<0.01,P<0.01),提示心梗大鼠模型建模成功。PGLV-shRNA经尾静脉注射后第7天,仍可见GFP标记的PGLV-shRNA分布在心肌细胞的胞浆及细胞核中。心梗术后第4周,与假手术组比较,PGLV阴性组FS、LVEF显著降低(P<0.01,P<0.01),LVEDD、LVESD显著扩大(P<0.01,P<0.01)。PGLV-shRNA组与PGLV阴性组相比,FS、LVEF明显升高(P<0.05,P<0.05), LVEDD、LVESD明显缩小(P<0.05,P<0.05)。与假手术组比较,PGLV阴性组大鼠心肌细胞凋亡、胶原容积分数(CVF)、P38MAPKmRNA、CTGF mRNA、CTGF蛋白、Caspase-3蛋白和a-SMA蛋白表达水平显著增加(Pall<0.01)。与PGLV阴性组比较,PGLV-shRNA组大鼠心肌细胞凋亡、CVF、 P38MAPKmRNA、CTGF mRNA表达、磷酸化P38MAPK蛋白、CTGF蛋白、Caspase-3蛋白和a-SMA蛋白表达水平明显降低。结论在细胞培养和心梗大鼠模型中发现,醛固酮经P38MAPK信号通路直接诱导心肌细胞凋亡,慢病毒介导的P38MAPK RNAi能够特异、高效地抑制醛固酮诱导的大鼠心肌细胞凋亡。TGF-β经P38MAPK信号通路直接诱导心肌成纤维细胞结缔组织生长因子表达,慢病毒介导的P38MAPK RNAi能够有效地抑制TGF-β诱导的心肌细胞纤维化。进一步印证了醛固酮过负荷大鼠心梗后心脏功能降低、心脏重构与P38MAPK信号通路密切相关,P38MAPK基因沉默可以改善醛固酮过负荷大鼠心肌梗死后的心脏功能和心脏重构。