第一部分鼻咽癌复发相关血清肿瘤标志物的筛选背景和目的鼻咽癌常是具有中国特色的肿瘤,广西、广东、福建等地是鼻咽癌高发区,目前放射治疗是鼻咽癌主要治疗手段。由于鼻咽癌发病部位隐蔽,临床症状不明显,诊断时往往分期已经较晚,给后期的治疗带来困难。即使经过有效治疗,仍然有10-15%左右的患者出现复发,复发后的再程放疗,患者的治疗及预后效果均不佳。现鼻咽癌复发的发病机制尚未明了,目前大多数研究认为鼻咽癌的放射抗拒是鼻咽癌复发的主要原因之一,同时,目前临床上仍没有可用于监测、诊断、治疗鼻咽癌复发相关的肿瘤标志物,本研究通过蛋白质组学技术筛选出鼻咽癌复发相关标志物,构建鼻咽癌复发相关蛋白质表达谱,为临床上鼻咽癌复发诊疗做出贡献。方法1.采集鼻咽癌复发和正常复查随访组患者的血清进行研究,所有患者严格按照入组标准入组。所有患者均为经过放射治疗后6个月,诊断为鼻咽癌复发或鼻咽癌正常复查随访病人,诊断明确后均在未予任何治疗的情况下进行采血,采血后静置离心,收集血清,分装进入-80度冰箱进行保存。复发患者随机抽取20个标本随机分入验证A、B两组(每组10人),正常复查随访患者随机抽取20个随机分入验证A、B两组(每组10人),复发组和正常复查随访组进行两两比较形成A、B两组,经提取蛋白和胰酶消化后,进行TMT标记后,联合多维固相/液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,进行搜库和Mascot search engine(v.2.3.0)软件分析,得到复发与正常复查随访间血清差异表达蛋白,并对质谱结果进行质控,同时对两次实验进行重复性分析。对差异蛋白进行生物信息学分析。结果1.血清中共鉴定出635个蛋白,其中可定量蛋白为413个,设≥1.2倍,≤0.83倍为差异倍数。两次实验中,在复发组均表现下调的为41个,均表现为上调的18个。并对2次独立实验结果的重复性进行检验,用散点图和皮尔森相关系数(Pearson’s Correlation Coefficient)进行分析。结果表明2次实验在统计学上一致。同时对酶解的肽段进行质控,肽段的质量及其分布符合质量要求。1.2对差异蛋白进行基于GO的二级注释分类,1.2.1上调蛋白主要参与单一结构过程(26个蛋白),细胞生理过程(25个蛋白),应激反应(20个蛋白),生物调节(19个蛋白),定位作用(14个蛋白),代谢过程(13个),信号传递(12个),多细胞多组织的生物学过程(12个)等等。细胞构成二级分类中,有23个分子位于胞内区,21个位于细胞器内,13个位于大分子化合物,11个位细胞膜内,10个分布在胞外区等。在分子功能分类中发挥与蛋白质结合功能,参与分子有15个。催化活性的激活有11个分子参与,有6个分子参与了分子结构激活,有3个参与了酶调节的激活,有1个参与电子活性的激活等。1.2.2下调蛋白中,生物学过程分类显示:主要参与单一结构反应过程(40个蛋白),生理调节过程(39个蛋白)细胞生理过程(27个蛋白),应激反应(35个蛋白),生物调节(19个蛋白),定位作用(13个蛋白),代谢过程(29个),信号传递(12个),免疫反应过程(17个),发育过程(12个),多细胞多组织的生物学过程(11个),多结构反应过程(8个)等等。细胞构成分类中,有23个蛋白位于胞内区,20个位于细胞器内,13个属于大分子化合物构成,20个位细胞膜内,37个分布在胞外区,34在细胞内等。分子功能分类中,上调蛋白主要发挥与蛋白质结合功能,参与蛋白有36个。催化活性的激活有9个蛋白参与,有6个参与了酶调节的激活,有5个参与运输活性,有3个参与抗氧化作用,有3个参与分子结构活性作用等。1.3基于GO富集分析1.3.1上调蛋白中,进行生物学过程富集度分析表明,差异蛋白主要集中在负向调节运输活性,调节细胞周期,细胞支架的组成,调节细胞周期的进程,负向调节分子功能,细胞吞噬作用。细胞构成主要富集在内肌质网腔,基质,粘着斑,细胞基质粘连等。分子功能主要富集在与脂蛋白颗粒结合,低密度脂蛋白颗粒结合,未折叠蛋白的结合,胆固醇的结合功能等。1.3.2下调蛋白中,富集度分析发现,差异蛋白主要参与自我保护反应,补体激活经典途径,免疫球蛋白调节免疫反应,淋巴调节免疫力,适应性免疫反应,对压力的应急反应,激活免疫反应等生物学过程;而在细胞构成的富集度分析中,差异蛋白主要为核小体,染色质、运输质子的ATP两部分酶,运输质子的ATP两部分酶化合物等;在分子功能的富集度分析中,主要参与抗原结合,运输质子的ATP合成酶,激活半胱氨酸肽链内切酶抑制剂,MHC经典途径蛋白结合。1.4 KEGG信号通路富集分析两次实验中均出现hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human),hsa04970 Salivary secretion-Homo sapiens(human),hsa05144 Malaria-Homo sapiens(human)3条通路。在KEGG数据库,hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human)丰度值最高、参与的基因数最多,最具有生物学意义。参与基因分别是CALM,H2B,H3,H4,其中基因CALM在细胞增殖、凋亡、自噬、肿瘤干细胞、DNA损伤、细胞运动、抗凋亡等作用相关。1.5结构域的富集度分析对差异蛋白的结构域进行富集度分析,发现差异蛋白主要为钙调蛋白同源结构域、小能量结合蛋白结构域等。1.6聚类分析对差异蛋白进行聚类分析发现,在第1聚类中共有19个蛋白(A2M,ACTN4,ALB,ALDOA,APP,CFD,F13A1,FN1,HRG,KNG1,PF4,PLG,PPBP,SERPINA1,SERPINE1,SERPING1,TIMP1,VWF)参与,其中,上调蛋白只有APP、SERPINE。下调蛋白包括A2M,ALB,F13A1,KNG1,SERPINA1,SERPING1。第二聚类中,包含APCS,APOA1,APOA4,CST3,F2,FGA,GSN,LTF,SERPINC1,TTR,其中,上调蛋白有APCS,FGA,SERPINC1。下调蛋白包括CST3,GSN。第三聚类中,包含APOA2,APOB,APOC3,APOE,LCAT,LPL,其中上调蛋白包含APOA2,没有下调蛋白。1.7蛋白质网络互作分析筛选出的所有蛋白进行网络互作分析,根据STRING网站进行结果分析,从差异蛋白相互作用的网络图和网络连接度看,网络图中连接程度较高的差异蛋白分别为ALB(degree=42)、APP(degree=34)、KNG1(degree=27)、F13A1(degree=25)、SERPING1(degree=25)、A2M(degree=24)、SERPINA1(degree=22)。FGA(degree=19)、SERPINC1(degree=16)、APCS(degree=10)、GSN(degree=10)、APOA2(degree=9)。结论1.本研究通过TMT联合质谱分析并筛选出鼻咽癌复发相关表达蛋白,初步构建了鼻咽癌复发相关差异蛋白表达谱;2.基于质谱结果,我们进行生物信息学分析挖掘鼻咽癌复发的可能机制,其中,我们认为CALM、A2M、APP、ALB、F13A1、KNG1、SERPINA1、SERPINE1等是鼻咽癌复发潜在的相关标志物,补体系统及CALM相关因素可能是鼻咽癌复发相关的机制之一。第二部分基于ELISA的血清差异蛋白表达验证背景及目的目前在蛋白质组学的实验中,质谱得出的结果往往需要进行后期的验证进一步证明质谱结果的可靠性,我们重新收集血清标本进行ELISA验证,同时探讨该蛋白在鼻咽癌复发中的可能机制。方法采集复发组50例和正常随访患者50例,进行后期ELISA的血清差异蛋白验证。我们选择CALM、A2M、APP三个蛋白进行验证。运用统计学软件SPSS21.0和Prism5.0进行统计分析。P值<0.05认为有统计学意义。结果1.CALM蛋白结果:由于CALM浓度不符合正态分布,我们选取中位数及四分位法对蛋白浓度进行描述,复发组和正常复查随访组CALM浓度中位数分别为114.2ng/l和45.10ng/l;第25%位数的浓度分别为56.08ng/l和23.08ng/l;第75%位数的浓度分别为240.1ng/l和181.8ng/l;认为两组之间CALM表达差异有统计学意义(P=0.0233),复发组表达量高于正常复查随访组。ROC曲线下面积为0.6931,CALM最佳界值点为48.45ng/l,灵敏度为82.8%,特异度为55%。2.APP蛋白结果:由于APP浓度不符合正态分布,我们选取中位数及四分位法对蛋白浓度进行描述,复发组和正常复查随访组APP浓度中位数分别为20.08ng/ml和5.502ng/ml,第25%位数的浓度分别为4.561ng/ml和4.508ng/ml。第75%位数的浓度分别为28.90ng/ml和10.26ng/ml,认为两组之间APP表达有统计学差异(P=0.044),复发组表达量高于正常复查随访组。ROC曲线下面积为0.666,APP最佳界值点为16.95ng/ml,灵敏度为55.2%,特异度为90.9%。3.A2M蛋白结果:由于A2M浓度不符合正态分布,我们选取中位数及四分位法对蛋白浓度进行描述,复发组和正常复查随访组A2M浓度中位数分别为34.79ng/ml和75.67ng/ml,第25%位数的浓度分别为13.27ng/ml和40.03ng/ml;第75%的浓度分别为61.86ng/ml和151.92ng/ml,认为两组之间A2M表达差异有统计学意义(Z=-3.177,P=0.001),不复发组表达量高于复发组。ROC曲线下面积为0.757,A2M最佳界值点为35.21ng/ml,灵敏度为56.5%,特异度为86.7%。结论经过ELISA验证,CALM、A2M、APP三个蛋白的表达趋势与质谱结果一致,这三者可能是鼻咽癌复发相关的肿瘤标志物。