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伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）,属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科,水痘病毒属成员,是一种有囊膜的双链线状DNA病毒,其基因组长度约150 kb。PRV对猪群危害严重,特别是2011年以来,我国一些已免疫PRV传统商品化疫苗的猪场出现了新一轮PRV感染疫情,后被证明是PRV变异株所致,给我国养猪业带来了严重打击。目前猪场对于PRV的防控主要依靠疫苗免疫。但因病毒不断变异,PRV疫苗保护效力面临巨大挑战,因此,构建抗PRV药物筛选平台,进一步筛选出有效的抗PRV药物并探索其作用原理将对PRV的防治具有重大意义。本研究首先利用双sg RNA CRISPR/Cas9系统对变异株PRV HN1201进行改造,成功构建了表达增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）和萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase,Luc）的双标记重组病毒r PRV HN1201-EGFP-Luc,并在体外和小鼠体内对重组病毒的生物学特性进行全面探索。然后利用构建的重组PRV对本实验室已有的小分子化合物库进行筛选,发现小分子化合物棉籽酚（Gossypol）对PRV具有显著的抑制作用。接下来进一步探索了Gossypol的抗PRV作用原理。（一）表达EGFP和Firefly Luciferase重组PRV的构建及体内外生物学特性为了获得一株在体内外均可便捷进行定量和示踪的PRV毒株,本研究设计将EGFP和Luc表达盒重组至伪狂犬病病毒变异株PRV HN1201。首先分别构建了双sg RNA CRISPR/Cas9基因编辑质粒p X459M-sg RNA1-sg RNA2、包含PRV g I/g E基因左同源臂US6/7和右同源臂US8/9并同时表达EGFP和Firefly Luciferase的供体质粒p UC57-US6/7-EGFP-Luc-US8/9,然后将上述质粒与PRV HN1201完整基因组共转染PK-15细胞,结合荧光标记进行重组病毒纯化,成功构建出了表达EGFP和萤火虫荧光素酶的重组病毒r PRV HN1201-EGFP-Luc。经检测显示重组病毒生物特性与亲本株相似,经过20代传代后仍显示出稳定的病毒滴度和荧光素酶活性。重组病毒的病毒滴度和EGFP与荧光素酶活性呈线性相关,说明重组病毒这三个特性指标均可用于评价重组病毒的复制。重组病毒在小鼠体内的活体成像结果显示,病毒感染后12小时即可在小鼠体内检测到生物发光信号。另外,通过使用25-羟基胆固醇进一步确定了该重组病毒可有效应用于体内外筛选抗PRV药物。（二）Gossypol的抗PRV作用及其原理探究利用重组病毒r PRV HN1201-EGFP-Luc对本实验室保存的小分子化合物库进行筛选,发现天然小分子化合物Gossypol对PRV具有明显抑制作用。CCK-8法检测发现3μM Gossypol处理PK-15和NIH-3T3细胞36小时无明显细胞毒性,流式细胞术和荧光显微镜检测发现Gossypol可明显抑制r PRV HN1201-EGFP-Luc。Western Blot检测显示Gossypol有效抑制PRV HN1201感染细胞后g E蛋白的表达,进一步确定了Gossypol对PRV的显著抑制作用。已知,Gossypol可通过影响线粒体功能或诱导细胞发生自噬等途径发挥抗肿瘤作用,具体作用途径因肿瘤细胞种类差异而不同。因此,本研究结合Gossypol生物学特性,从线粒体损伤、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、自噬、能量代谢和病毒生活周期等多方面对Gossypol的抗PRV原理进行全面分析。首先,共聚焦显微镜检测发现Gossypol引起PK-15细胞线粒体长度变短,导致线粒体由长的分支状变为点状,通过JC-1荧光探针检测发现Gossypol作用导致PK-15细胞线粒体膜电位降低,推测Gossypol可能导致线粒体DNA泄漏进而刺激胞质DNA感受器,最终刺激干扰素产生而发挥抗病毒作用。但q PCR检测结果显示Gossypol作用于PK-15细胞后对其线粒体DNA量没有影响,而且对细胞IFN-β水平也没有明显影响。说明Gossypol并非通过该推测途径发挥抗PRV作用。检测特定浓度Gossypol处理PK-15细胞后ROS水平,发现3μM浓度以内Gossypol处理PK-15细胞24小时没有导致胞内ROS水平升高。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）或还原性谷胱甘肽（GSH）和Gossypol联合用药,对Gossypol的抑制PRV作用没有任何缓解,说明Gossypol不通过ROS途径发挥抗PRV作用。另外,检测发现Gossypol处理PK-15和NIH-3T3细胞24小时后,随着药物浓度的升高,细胞内的ATP水平逐渐降低。试验发现单独添加ATP时促进了PRV增殖,但将Gossypol和ATP同时处理PK-15细胞并接毒r PRV HN1201-EGFP-Luc时,ATP的加入对于Gossypol的抑制PRV作用无明显影响,提示,Gossypol的抗PRV作用是ATP非依赖性的。Western Blot检测发现Gossypol作用于PK-15和NIH-3T3细胞导致LC3-II蛋白表达增多,P62蛋白表达量下降,结合药物作用后细胞内自噬斑点的明显增多表明Gossypol诱导细胞发生了自噬。然而,当通过敲除PK-15细胞的自噬相关蛋白Atg 5或添加自噬抑制剂3-MA时,Gossypol对于PRV抑制作用依然不受影响,表明Gossypol对于PRV抑制作用是自噬非依赖性的。通过病毒滴度测定法检测了Gossypol对PRV生活周期的影响,结果Gossypol对PRV的吸附阶段具有明显抑制作用,但对PRV的进入、复制和释放阶段均无明显影响。q PCR和原子力显微镜检测均证明Gossypol抑制PRV在细胞表面的吸附。分子对接分析结果显示Gossypol可与g B三聚体蛋白融合环区域结合,可能通过这种结合使g B三聚体蛋白失去了与细胞膜结合的能力,进而发挥抗PRV吸附作用。综上所述,本研究通过设计双sg RNA CRISPR/Cas9单质粒系统实现了对PRV HN1201的快速精准改造,该病毒改造策略不仅可以用于将外源基因插入PRV基因组中,而且还可以用来实现PRV大基因片段的有效缺失。试验获得了一株同时表达EGFP和萤火虫荧光素酶双标记的重组病毒r PRV HN1201-EGFP-Luc,实现了PRV在体内和体外的双重示踪,为PRV基础研究和体内外抗PRV药物筛选打下了坚实基础。利用重组病毒r PRV HN1201-EGFP-Luc筛选到的抗PRV天然化合物Gossypol,主要通过阻止病毒在细胞表面吸附而发挥抗PRV作用。