由于具有非接触、无损伤、可实时探测生物样品内部等优点，远场光学显微镜一直是生命科学及相关领域最常用的研究工具，但是由于光学衍射极限的存在，限制了对亚细胞尺度上生理过程的观测和研究。经过近十多年的发展，多种光学超分辨技术已逐渐成熟并广泛应用，尤其是受激辐射耗尽(STED)显微镜凭借其超高分辨率和三维层析能力，成为备受关注的新型成像工具。为了深入研究不同生物分子间的相互作用，以更好地理解细胞的生化过程，发展双色甚至多色STED超分辨显微镜具有重要意义，但是目前双色STED成像技术的发展还处于起步阶段。　　在本论文研究中，自主设计并搭建了一套双色STED超分辨成像系统，建立线扫描时间门分离法解决了通道间的交叉干扰问题，并利用该系统研究了新生成转化生长因子TGF-β受体的细胞内转运及TGF-β信号通路中重要信号蛋白的相互作用。　　TGF-β信号通路在细胞增殖、分化等多种生理过程中具有重要的调控作用，而其信号紊乱与肿瘤发生发展、组织纤维化、心血管等多种疾病密切相关。课题组前期通过活细胞成像，发现新合成的TGF-βⅡ型受体可以在细胞质中以点状聚集体的形式存在，推测其为一种新的后高尔基体囊泡;还发现Clathrin和Caveolae内吞囊泡在介导TGF-β受体进入细胞后发生融合，形成具有多种功能的Caveolin-1阳性早期内涵体。但是由于受光学衍射极限的限制，所用荧光光学显微镜无法观察到这些囊泡的结构，也无法确定相关信号蛋白在Caveolin-1阳性早期内涵体上的定位及相互作用。因此本论文旨在通过建立双色STED超分辨成像系统来解决上述问题，主要研究内容如下:　　第一部分，自主设计并搭建了一套双色STED超分辨成像装置，选择一台超连续脉冲激光器作为唯一激光光源，提供实验中所需的两束激发光和一束公用STED损耗光。设计使用激发光谱不同、发射光谱相近的两种荧光染料作为双色标记探针，并且基于这两种荧光分子的激发和发射光谱确定了双通道成像装置中所使用的两束激发光、一束公用STED损耗光以及两个荧光信号收集通道的光谱范围。完成装置搭建后对40nm荧光微球的成像结果显示，两个成像通道可分别获得40nm和80nm的超高成像分辨率，但是在双通道同时成像时发现两个通道间存在一定程度的交叉干扰问题。　　第二部分，针对双色STED成像装置出现的不同荧光信号通道间交叉干扰问题，提出通过在两个激发光光路中添加时序快门的方式来实现线扫描时间门分离法，并对所搭建的成像装置和控制采集程序进行了相应的改进，最终在不影响两个通道成像分辨率的前提下成功解决通道间的交叉干扰问题。　　第三部分，利用双色STED成像装置的单通道超分辨成像能力，研究了细胞质中的TGF-β受体囊泡，首次实现了含TGF-βⅡ型受体后高尔基体囊泡的超分辨成像，观察到其环状轮廓结构;进一步的研究发现新生成的TGF-βⅡ型受体在后高尔基体囊泡膜上以聚集体的形式分布，这可能有利于提高其上膜后的信号传导效率。实验结果也表明STED超分辨显微镜可成为一种研究细胞内蛋白纳米尺度分布的重要工具。　　第四部分，首先利用单通道的超分辨成像，首次实现对Clathrin和Caveolae内吞囊泡环状结构的STED成像;然后通过双色超分辨成像，观察到Clathrin和Caveolae内吞囊泡的半融合结构，证实了过去关于Clathrin和Caveolae内吞融合囊泡的推断。也发现大多数在共聚焦成像模式下处于共定位的这两种囊泡，在STED超分辨模式下并不存在共定位，这也说明传统共聚焦显微镜往往不能准确反映细胞内处于衍射极限范围内的不同组分的位置关系，因此，双色STED超分辨成像技术提供了一种更加精确、便捷的方法来研究亚细胞尺度的蛋白相互作用。