恶性肿瘤是严重威胁人类健康的的主要疾病之一,全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症。目前,大多数的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效,但仍然存在着副作用大、价格昂贵等诸多劣势。因此,寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物是我们面临的巨大挑战。我国的传统医学在治疗肿瘤方面有着悠久的历史,中草药中含有多种具有很强抗肿瘤作用的植物单体,如何将其分离提取出来并进行合理的开发利用,成为了世界医学面临的重要课题。现代药理学研究证明,中药牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。其主要有效成分牛蒡苷(Arctiin,ARC)在人体内生物利用度低,需经肠道微生物酶解转化为牛蒡苷元(Arctigenin,ARG)方能吸收入血液,发挥药效。目前,药学研究用ARG多为实验室自制,其制备方法都或多或少存在着一些不足之处,如提取效率低、步骤繁杂、对实验室设备要求高等。本研究采用微生物发酵法和硅胶柱层析法从牛蒡子粉中分离纯化ARG,成功建立了一种简便高效的提取方法。此外,据相关报道,ARG可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,但对于其抗肿瘤作用的分子机制却知之甚少。本研究选取人肝细胞癌作为研究对象,对ARG体内外抗肿瘤机制进行了深入探讨。ARG的制备:本研究采用微生物发酵法,筛选出泡盛曲霉变种和里氏木霉作为发酵菌种,利用两株霉菌所产生的生物酶对牛蒡子粉进行炮制,将牛蒡子粉中的牛蒡苷转化为牛蒡苷元。并且通过对发酵过程中碳源、氮源、发酵时间、p H、装液量、接种量、发酵底物固液比、碳氮比等诸多因素进行优化,制定出一套牛蒡子粉最佳发酵工艺,可使牛蒡苷转化率达97.8%,产物溶出率达95.7%,损失率低至4.3%。最后采用硅胶柱层析法纯化牛蒡子发酵粗提物,牛蒡苷元纯化产物为白色晶体,纯度可达到99%以上。ARG体外抗肿瘤机制研究:通过MTT比色法检测ARG在体外对肿瘤细胞株和正常细胞株的增殖抑制活性,结果表明ARG具有良好的广谱抗癌活性,但对正常细胞却没有明显的抑制作用。为进一步研究ARG的抗肿瘤机制,本研究选择人肝细胞癌作为研究对象,通过Annexin V-FITC/PI双染法、透射电镜观察、线粒体跨膜电位检测、和Hoechst33342/免疫荧光染色等试验方法从细胞形态学和分子生物学角度说明ARG可以诱导Hep G2和SMMC7721细胞的凋亡。而后,采用q PCR、流式细胞仪和Western blot等试验技术检测细胞凋亡信号通路及凋亡相关因子。结果发现,当ARG作用于Hep G2细胞时,首先会破坏细胞线粒体的氧化还原功能,同时使NADPH酶和细胞色素P450酶参与的代谢过程发生异常,从而导致细胞中ROS水平升高。在ROS的影响下,MAPK信号通路中JNK和p38被激活,两者共同促进了Hep G2细胞内源性凋亡途径的活化,于此同时,p38参与激活其外源性凋亡途径并上调p53的表达。最终,在两条凋亡途径共同作用下,细胞中的caspase蛋白群被激活,从而介导了Hep G2凋亡的发生。此外,ARG还可以抑制Hep G2细胞中NF-κB的核转移和PI3K/Akt信号通路的激活。上述结果表明ARG是一种“多靶点”化合物,它可以通过调节细胞中的多种信号转导来诱导细胞的凋亡。ARG体内抗肿瘤机制研究:在对裸鼠人肝癌移植瘤进行体内抑癌作用研究中发现,ARG对人肝癌移植瘤具有显著的抑制作用,20 mg/kg ARG对Hep G2移植瘤抑瘤率可达44.55%。并且几乎不会对荷瘤小鼠的一般状态及肝、肺、肾等主要脏器产生不良影响。进一步研究发现,ARG在体内抑制肿瘤组织的生长是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。其主要作用机制是通过上调p-JNK、p-p38、Bax以及TNF-α的表达介导细胞凋亡的发生。ARG体内抗肿瘤研究说明ARG不仅可以抑制肿瘤的生长,同时具有低毒的作用特点,此研究结果为ARG的进一步开发奠定了试验基础。综上所述,本研究发明建立了一种简便高效的ARG提取方法,适合于实验室自行提取制备ARG,并且此方法具有成本低廉、提取纯度高、污染少等诸多优点。在此基础之上,本研究对ARG的抗肿瘤作用及其体内外作用机制进行了深入探索。研究结果表明,ARG在体内外均具有良好的抗肿瘤作用,其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,研究还发现ARG在体外几乎不会对正常组织细胞产生抑制作用,且在动物体内具有低毒的作用特点。由此可见,ARG是一种极具开发潜力的抗肿瘤化合物,本项研究为ARG的进一步开发利用奠定了试验基础。