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背景胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor,IGF）信号系统包括两个配体（IGF-1和IGF-2）、两个受体（IGF-1R和IGF-2R）和6个IGF结合蛋白。大量研究证实IGF信号系统在促进肿瘤生长和存活中发挥重要作用,包括食管癌在内的多种肿瘤中存在IGF-1R的过量表达。但抗IGF-1R单克隆抗体在临床试验中的疗效不佳,一方面与未找到预测疗效的生物标志物,不能从中筛选可获益的病人类群有关;另一方面与胰岛素受体（Insulin Receptor,IR）旁路途径的代偿作用密切相关。IR有两个同源异构体:IR-A和IR-B。IR-A在多种肿瘤中高表达,主要传递细胞增殖和存活信号,而IR-B则主要与胰岛素结合,调控体内葡萄糖代谢。当IGF-1R通路被抑制后,肿瘤细胞可能通过IR-A通路进行信号转导。因此,我们推测肿瘤细胞对IGF-1R抑制剂的耐药机制可能与IGF-1R/IR-A旁路途径的代偿作用有关。目的明确IR信号通路在食管鳞癌细胞对IGF-1R特异性抑制剂AXL1717耐药中的作用并阐明其机制,从而为IGF-1R抑制剂用于食管鳞癌的治疗提供必要的实验数据和理论基础,为食管癌的靶向治疗探索新的方案。方法1.采用MTT法检测IGF-1R特异性抑制剂AXL1717对8种食管鳞癌细胞系的生长抑制作用,并筛选出对AXL1717最敏感和最不敏感的细胞系。2.Western blot实验检测8种食管鳞癌细胞表面IGF-1R、IR、p-IGF-1R、p-IR的表达水平,采用Graph Pad Prism 5软件将其与AXL1717对细胞的IC50值进行Pearson相关性分析。3.RT-PCR技术检测8种食管鳞癌细胞系中的IR-A、IR-B基因表达水平,之后将IR-A:IR-B的比值与对AXL1717的IC50值进行Pearson相关性分析。4.采用PI染色法检测AXL1717对食管鳞癌细胞周期进程的影响。5.采用RNAi技术将IR干扰性sh RNA转染至对AXL1717不敏感的食管鳞癌细胞系中,再分别采用MTT实验和Annexin V-FITC/PI双染实验检测IR水平敲减前后AXL1717抑制细胞增殖和诱导凋亡能力的变化。6.采用过表达技术将IR质粒转染至AXL1717敏感食管鳞癌细胞系中,再分别采用MTT实验和Annexin V-FITC/PI双染实验检测IR水平过表达前后AXL1717抑制细胞增殖和诱导凋亡能力的变化。7.Western blot技术检测IR过表达或敲减前后AXL1717处理对食管鳞癌细胞中IGF-1R和IR及其主要下游信号通路分子IRS-1、AKT和ERK表达水平的影响。结果1.IGF-1R特异性抑制剂AXL1717对8种食管鳞癌细胞系均具有显著的增殖抑制活性,其IC50值分别为48.32μmol/L、0.01μmol/L、0.47μmol/L、0.80μmol/L、0.41μmol/L、0.07μmol/L、0.87μmol/L和7.81μmol/L。2.Pearson相关性分析显示,8种食管鳞癌细胞对AXL1717的敏感程度与细胞表面IGF-1R、IR、p-IGF-1R和p-IR的表达水平无关（P>0.05）,但与IR-A/IR-B的比率密切相关（P<0.05）。3.采用脂质体法成功将IR表达质粒h IR-GFP转染至AXL1717敏感食管鳞癌细胞KYSE450和EC109,将含有IR特异性sh RNA的质粒sh IR#D转染至AXL1717不敏感细胞EC9706和TE-7。4.食管鳞癌细胞体外增殖抑制实验结果显示,与未转染组相比,转染IR表达质粒后,AXL1717对KYSE450和EC109的增殖抑制作用明显减弱。与此相反,转染IR特异性sh RNA后,AXL1717对EC9706和TE-7细胞的增殖抑制作用显著增强。5.细胞周期实验结果显示,AXL1717诱导食管鳞癌细胞阻滞于S期和G2/M期。6.细胞凋亡实验结果显示,AXL1717可浓度依赖性地诱导食管鳞癌细胞EC9706、EC109、KYSE450和TE-7发生凋亡。此外,在KYSE450细胞中过表达IR质粒后,其对细胞凋亡的诱导能力显著下降（P<0.001 vs空载体转染）。而在EC9706细胞敲低IR后,AXL1717的诱导细胞凋亡能力则显著增加（P<0.001 vs mock转染）。7.Western blot结果显示,AXL1717处理对其敏感的KYSE450和EC109细胞后,KYSE450细胞中IGF-1R、IR以及下游的IRS-1、AKT和ERK的磷酸化水平降低,且呈浓度依赖性;EC109细胞中IGF-1R和IR的磷酸化水平没有明显变化,但IRS-1和ERK的磷酸化水平下降,这表明IGF-1R抑制剂AXL1717可显著抑制IGF-1R和IR信号通路的激活。8.Western blot结果显示,AXL1717处理对其不敏感的TE-7和EC9706细胞后,TE-7细胞中IGF-1R和下游AKT、ERK的磷酸化水平下降,但IR和重要接头分子IRS-1的活化水平上升;EC9706细胞中IGF-1R和IR以及IRS-1的磷酸化水平显著升高,这可能是EC9706细胞相对AXL1717耐药的原因之一。9.Western blot结果显示,KYSE450细胞在IR过表达后再用AXL1717处理导致IGF-1R和IR的磷酸化增加,接头蛋白IRS-1和AKT的活化水平也随之升高,这表明IR的过表达抵消了IGF-1R抑制剂AXL1717对IGF-1R和IR信号通路活化的抑制作用。当EC9706细胞转染IR sh RNA质粒后,AXL1717在0.3μmol/L浓度下可逆转IGF-1R和IR磷酸化水平的升高,但IRS-1和AKT、ERK的活化并没有受到抑制。结论1.IGF-1R特异性抑制剂AXL1717对食管鳞癌细胞具有显著的增殖抑制能力和诱导凋亡能力,且食管鳞癌细胞对AXL1717的敏感性与细胞中IR-A/IR-B的比率密切相关。2.IR在食管鳞癌细胞对AXL1717的耐药中发挥重要作用,过表达或敲低IR后,AXL1717对食管鳞癌细胞的增殖抑制能力和凋亡诱导能力相应降低或增强,其耐药机制与细胞通过IR通路进行信号传导,从而抵消AXL1717对IGF-1R及其下游信号分子活化的抑制有关。