引导神经细胞正确的分化和成熟，使得神经细胞最终能行使其正常的功能，是神经组织工程和神经干细胞治疗中一个至关重要的目标和方向。目前研究了多种纳微米尺度下具有特定形貌（如微槽、纳米坑、纳米纤维等）的生物材料对神经细胞的影响。其中，电纺定向纳米纤维因能模仿细胞外基质和提供适合的接触引导来帮助神经细胞分化及神经突触生长，受到许多研究者的青睐。对于定向纳米纤维影响神经细胞分化的分子机理研究，目前主要是采用传统的分子生物学技术来研究，发现了单个或少量发挥重要作用的基因和蛋白质。然而在神经组织工程中进一步应用定向纳米纤维和设计对神经细胞有可控能力的纳米纤维材料表面，需要全面深入地阐释定向纳米纤维影响神经细胞分化的分子机理，而这离不开整体性大范围内了解基因或蛋白质的变化，传统的分子生物学技术显然不能满足这一需要。近年来出现的高通量技术（基因表达谱芯片、测序等）和系统生物学方法为从RNA、蛋白质、代谢物等层次，全面系统地了解生物材料对细胞的影响和深入研究分子机理提供了强有力的技术方法支持。本论文的研究内容是课题组申请的国家自然科学基金项目“定向纳米纤维诱导神经细胞生长机理的系统生物学研究”的一部分，旨在通过综合运用基因表达谱芯片技术、SOLiD测序技术、生物信息学方法和分子生物学技术，从RNA水平（这里主要是mRNA和microRNA）系统分析电纺左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向纳米纤维对PC12细胞分化及mRNA、microRNA表达谱的影响，揭示并验证PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化的分子机制，从而拓宽人们对定向纳米纤维影响神经细胞分化分子机理的认识，为最终从系统生物学角度阐释定向纳米纤维影响神经细胞分化的分子机制以及在神经组织工程等领域中设计和应用纳米纤维打下基础。　　本论文的具体工作如下:　　1、采用静电纺丝技术成功制备出PLLA不定向/定向纳米纤维。由化学组成相同的PLLA溶液均匀涂覆在聚苯乙烯基底上制得PLLA薄膜。使用扫描电镜、红外光谱仪等对制得的三种PLLA基底（PLLA不定向纳米纤维、PLLA定向纳米纤维和PLLA薄膜）进行表征，发现制备的PLLA不定向/定向纳米纤维粗细均匀且无串珠，PLLA薄膜基本光滑平整。PLLA定向纳米纤维具有明显的取向性。PLLA不定向/定向纳米纤维的直径分别为238.68±5.77nm和217.83±7.00nm。三种PLLA基底的化学组成相同，均为左旋聚乳酸。力学性能检测发现，纳米纤维的取向性对其拉伸强度有很大的影响，PLLA定向纳米纤维的弹性模量（860.95±76.58MPa）显著大于PLLA不定向纳米纤维(131.71±13.71MPa)。　　2、将分化中的PC12细胞分别种植在PLLA薄膜（对照组）、PLLA不定向纳米纤维(RF组)和PLLA定向纳米纤维(AF组)上，并从细胞活力、葡萄糖乳酸代谢、细胞形态、神经突触长度等角度评价了PLLA纳米纤维对PC12细胞的影响。结果显示，PLLA不定向/定向纳米纤维能提高PC12细胞的活力和葡萄糖乳酸的代谢水平，同时PLLA不定向/定向纳米纤维能影响PC12细胞神经突触的伸展，尤其是PLLA定向纳米纤维能显著促进PC12细胞神经突触的生长，这提示PLLA定向纳米纤维可能有助于PC12细胞的分化。　　3、进一步采用qRT-PCR技术检测PC12细胞内GAP43基因（一种神经细胞分化的标志基因）的表达，结果表明AF组中GAP43基因的表达水平显著高于对照组和RF组。这一结果说明，与PLLA薄膜和PLLA不定向纳米纤维相比，PLLA定向纳米纤维更利于PC12细胞的分化。基因表达谱芯片实验分析PC12细胞内的mRNA表达谱，发现与对照组相比，RF组和AF组中分别有876和1937个基因发生差异表达。对RF组和AF组中的差异表达基因进行GO功能分析，发现分别有493和1193个差异基因与神经细胞分化相关，可见PLLA定向纳米纤维比PLLA不定向纳米纤维触发更多神经细胞分化相关的基因发生差异表达。通路分析和qRT-PCR、Western blot等验证实验进一步确认PLLA定向纳米纤维能激发整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK通路相关基因和蛋白（Tln1，Map2k5和磷酸化ERK1/2等）的表达;而采用GRGDS五肽竞争性干扰PLLA定向纳米纤维上PC12细胞的整联蛋白，能显著阻碍PC12细胞分化和降低整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK通路相关基因和蛋白的表达。此外本论文还采用RNA干扰技术发现Pafah1b1基因的上调表达也有利于PC12细胞的分化。这些结果表明PLLA定向纳米纤维可能通过表面吸附的蛋白质与PC12细胞整联蛋白发生作用，触发整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK信号通路激活及Pafah1b1等基因上调表达，从而促进PC12细胞的分化。　　4、采用SOLiD测序技术全面分析了PLLA不定向/定向纳米纤维对PC12细胞内microRNA表达谱的影响，并用qRT-PCR技术对测序结果进行验证。随后使用生物信息学方法对差异表达microRNA的靶基因进行了预测，并分析靶基因的生物学功能。结果显示，RF组和AF组中分别有42个和94个microRNA发生差异表达，AF组中的差异表达microRNA调控的相应靶基因和信号通路也更多。RF和AF组中的差异表达microRNA均能影响整联蛋白介导的细胞粘附通路、粘着斑信号通路中相关基因的表达，这提示PLLA不定向/定向纳米纤维可能引发microRNA对整联蛋白相关信号通路进行综合调控，从而对PC12细胞的分化产生作用。　　5、通过联合分析PC12细胞内的microRNA和mRNA表达谱，以实验实际检测到的差异表达基因验证差异表达microRNA的靶基因，本论文全面系统地研究了PLLA不定向/定向纳米纤维影响PC12细胞分化过程中关键的microRNA及其调控的靶基因和生物学功能。结果显示，PLLA不定向纳米纤维没有发现能引起与神经细胞分化密切相关的microRNA发生差异表达，而PLLA定向纳米纤维可能通过miR-18a、miR-23b、miR-103、miR-107、miR-92a、miR-339-5p、miR-25等调控Rras2、 Nf1、Pafah1b1基因，进而调控细胞骨架信号通路、MAPK信号通路，对PC12细胞的迁移、分化产生作用。此外，本论文还发现miR-185、miR-186、miR-148b-3p等microRNA在PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞的轴突导向、迁移等功能中可能发挥重要的调控作用。　　6、本论文在发现GRGDS五肽竞争性干扰PC12细胞的整联蛋白，能显著阻碍PLLA定向纳米纤维对PC12细胞分化的促进作用和降低整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK通路相关基因和蛋白的表达后，进一步通过采用基因表达谱芯片技术和SOLiD测序技术，全面系统的分析了种植在PLLA定向纳米纤维上的PC12细胞在受到GRGDS五肽干扰后（GA组），胞内mRNA和microRNA的变化。结果显示，与未受到GRGDS五肽干扰的正常PLLA定向纳米纤维组（AF组）相比，GA组中有1594个基因显著上调表达，1436个基因显著下调表达;GA组中共有23个microRNA显著下调，共有73个microRNA显著上调。联合分析mRNA表达谱与microRNA表达谱并综合前面的实验结果，本论文发现整联蛋白受到GRGDS五肽竞争性干扰后，PLLA定向纳米纤维上的PC12细胞分化受到抑制，同时触发胞内14个microRNA（miR-27a、miR-27b、miR-342-5p、miR-23a等）调控10个基因（Ndfufs4、Ppp1r3b、E2f1、Rras2等），影响PC12细胞的氨基酸代谢、生物合成、细胞骨架、细胞周期等多个方面的功能，可见整联蛋白在PLLA定向纳米纤维促进PC12细胞分化过程中发挥中至关重要的介导作用。