本论文采用快速高分辨液相色谱(RRLC)分离系统与MS/MS技术联用的高通量分析方法,建立了适用于肺癌血浆样本的非靶向与靶向代谢组学相结合的研究方法,并将其应用于大批量肺癌样本的研究,筛选出一批与肺癌诊断密切相关的可靠的潜在生物标志物。本研究在实验室前期研究的基础上,进一步优化并建立了基于RRLC-MS/MS技术的血浆非靶向代谢组学分析方法。首先,采用该方法对不同温度下放置不同时间的全血和血浆样本中内源性代谢物的短期稳定性,血浆样本在-80℃条件下放置约5年的长期稳定性进行了系统考察,探究了血浆内源性代谢物在不同条件下的变化规律。本研究结果不仅可辅助潜在生物标志物的识别,还可为代谢组学研究中针对血液样本的采集、制备和储存等操作提供指导依据。在此基础上,将非靶向RRLC-MS/MS分析方法应用于大批量肺癌患者与健康志愿者血浆样本的非靶向代谢组学研究,发现了74个存在显著性差异的内源性小分子代谢物。随后,以这些差异代谢物为研究对象,建立了基于RRLC-MS/MS联用技术的靶向代谢组学高通量分析方法,并将其应用于对肺癌诊断生物标志物的验证与确认。通过对新一批肺癌患者与健康志愿者的血浆样品进行分析,筛选出38个与肺癌诊断密切相关的潜在生物标志物。采用高分辨MS及MS/MS谱分析及其质谱裂解规律的解析,结合代谢相关性网络分析、数据库检索分析推断可能生物标志物的结构,共鉴定其中32个潜在生物标志物的结构。此外,通过对潜在生物标志物的代谢途径进行分析,推断肺癌可能与脂肪酸代谢存在密切关系。本论文的研究内容主要包括以下四个部分：1.血浆非靶向代谢组学的LC-MS/MS分析方法研究本论文在实验室前期血浆代谢组学研究的基础上,通过对血浆样品的前处理条件、色谱条件和质谱条件的进一步优化,尤其对复溶溶剂进行了细致的考察,对该方法的精密度、灵敏度和稳定性进行验证,建立了稳定、可靠的适用于非靶向代谢组学研究中血浆样品分析的RRLC-MS/MS检测方法。研究发现离心浓缩后的血浆样品采用不同溶剂复溶会引起不同的色谱行为,该现象严重影响了分析数据的重复性,以及后期代谢物的识别。因此,本研究对不同比例的乙腈水溶液引起溶剂效应的影响范围与程度进行了系统考察,最终确定初始流动相(乙腈：水；2：98)作为复溶溶剂。此外,对优化后的分析方法进行了一系列方法学考察,包括精密度、灵敏度和稳定性,结果表明本方法的精密度符合生物样品分析的要求,大部分代谢物的检测灵敏度较高,且分析过程中样本稳定性良好,适用于血浆样品的非靶向代谢组学分析。2.血浆代谢物的稳定性研究本研究采用正、负离子模式相结合的RRLC-MS/MS分析方法,结合多变量统计分析,针对不同温度(37℃和4℃)下放置不同时间(0、1、2、4、8、12、24h)的全血和血浆样本中内源性代谢物的短期稳定性,以及血浆样本在-80℃条件下放置约5年的长期稳定性进行了系统考察。通过主成分分析(PCA)法分析代谢物整体轮廓的变化,并结合10类代谢物时间依赖性变化规律的分析,对代谢物的短期稳定性进行了考察。在血浆样本的长期稳定性研究中,采用以正交最小二乘判别分析(OPLS-DA)为核心的多变量统计方法,分析识别了具有显著性变化的内源性代谢物,并鉴定出其中36个代谢物的结构,还发现了一类具有百倍变化的代谢物。本研究结果不仅通过不稳定代谢物的差异变化辅助潜在生物标志物的识别,还可以为靶向与非靶向代谢组学研究中血液样本的采集、制备和储存等操作提供指导依据。3.非靶向分析方法在肺癌代谢组学研究中的应用将以上建立的非靶向代谢组学RRLC-MS/MS分析方法,应用于232例肺癌患者与155例健康志愿者血浆样品的代谢组学研究中,以寻找与肺癌诊断相关的潜在生物标志物。运用该方法发现了74个代谢物的含量在肺癌患者与健康志愿者血浆中存在显著性差异,而且这些代谢物的异常可能与肺癌患者体内的代谢紊乱存在密切关系。进一步采用高分辨MS及MS/MS谱分析及其质谱裂解规律的解析,结合代谢相关性网络、数据库检索分析推断这些差异代谢物的结构,共鉴定出50个差异代谢物的结构,其中包括18个溶血磷酸胆碱、17个脂酰肉碱(含8个p-羟基脂酰肉碱)、7个β-羟基脂肪酸等。同时,选择相关代谢物的标准品进行LC-MS/MS谱比较分析,确认了12个差异代谢物的结构。4.基于靶向代谢组学的肺癌诊断生物标志物验证采用正、负离子检测模式相结合的RRLC与QTRAP型MS/MS联用技术,以非靶向代谢组学发现的74个差异代谢物为研究对象,开展了基于RRLC-MS/MS的MRM靶向分析方法研究,并针对该方法的精密度、灵敏度进行了验证,建立了可靠、灵敏、快速的适用于血浆中可能生物标志物的靶向分析方法。结果表明,本方法的精密度符合生物样品的分析要求,具有较高的检测灵敏度,能够满足血浆样品靶向代谢组学分析的要求。采用该分析方法对91例肺癌患者与66例健康志愿者的血浆样品进行分析,结果从上述74个差异代谢物中筛选出38个与肺癌诊断密切相关的潜在诊断标志物。分析鉴定出其中32个代谢物的结构,包括17个脂酰肉碱(含8个β-羟基脂酰肉碱)、7个β-羟基脂肪酸、1个溶血磷酸胆碱等。此外,研究发现脂酰肉碱以及β-羟基脂肪酸的含量在肺癌患者血浆中明显下降,通过潜在生物标志物之间相关性和代谢途径的进一步考察,分析推断肺癌可能与脂肪酸代谢存在密切关系。