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研究背景:肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,Mp）是引起社区获得性肺炎的主要病原体。Mp感染机体后,可黏附、定植于呼吸道黏膜上皮细胞,通过甘油代谢产生一系列活性氧（reactive oxygen species,ROS）;其脂质相关膜蛋白（lipid-associated membrane proteins,LAMPs）可激活吞噬细胞产生肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白细胞介素1β（interleukine 1β,IL-1β）和白细胞介素6（interleukine 6,IL-6）等促炎细胞因子和ROS。因此,Mp必须具备抗氧化和抗炎系统,以逃避氧化应激和炎症损伤清除。蛋氨酸（Methionine,Met）是生物体内的必须氨基酸之一,也是最易被氧化的氨基酸。Met可被ROS氧化形成蛋氨酸亚砜（methionine sulfoxide,Met O）,产生S型和R型两种非对映异构体,进而损伤破坏蛋白的结构与功能。蛋氨酸亚砜还原酶A（methionine sulfoxide reductase A,Msr A）广泛存在于所有真核生物和细菌中,能够将S型Met O还原成Met,修复氧化蛋白并消耗ROS,幽门螺杆菌、生殖支原体、大肠埃希菌和结核分枝杆菌等多种细菌的Msr A均有抗氧化的作用。此外,大肠埃希菌、生殖支原体和肺炎链球菌等细菌的Msr A还是一种毒力因子,参与细菌的黏附、运动、在体内和细胞内的生存、生物被膜形成。生殖支原体的Msr A还可抑制细胞分泌促炎细胞因子。目的:Mp Msr A由mpn607/msr A基因编码,分子量约17 k D,目前尚无Mp Msr A抗氧化和抗炎活性的报道。本研究旨在研究Mp Msr A还原Met O的酶活性并明确酶活性的关键位点;了解Mp Msr A对LAMPs刺激的THP-1来源的巨噬细胞细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和产生ROS的影响。研究可丰富Mp的抗氧化和抗炎系统,进一步了解Mp的免疫逃避机制及其与宿主细胞的相互作用。方法:1.从Genbank获取msr A基因序列,人工合成msr A的DNA序列,构建原核表达重组质粒p ET28a（+）-msr A。将重组质粒转化至表达菌E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达重组蛋白、Western blot鉴定、Ni2+-NTA亲和纯化后用BCA试剂盒测定蛋白浓度。DTNB-DTT显色法测定r Msr A还原Met O的活性。2.根据文献及生物信息学分析预测Msr A还原Met O的酶活性关键位点。人工合成msr A-S10（第29位碱基由G突变为C,使第10位半胱氨酸突变为丝氨酸）和msr A-A10（第28和29位碱基由T和G分别突变为G和C,使第10位半胱氨酸突变为丙氨酸）。构建重组质粒p ET28a（+）-msr A-S10和p ET28a（+）-msr A-A10,IPTG诱导表达突变重组蛋白r Msr A-S10和r Msr A-A10、Western blot鉴定、Ni2+-NTA亲和纯化,BCA试剂盒测定蛋白浓度。DTNB-DTT显色法测定两个重组突变蛋白还原Met O的活性。3.用纯化的r Msr A免疫六周龄BALB/c雌鼠,制备r Msr A多克隆抗体,ELISA测定其效价。用不同浓度的过氧化氢（H2O2）或叔丁基过氧化氢（tert-Butysl hydroperoxide,t-BHP）刺激对数期的Mp,逆转录PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）分析msr A基因m RNA的转录水平,Western blot检测Msr A蛋白表达水平。4.抽提Mp LAMPs,用BCA试剂盒测定浓度。用PMA处理将THP-1细胞诱导成巨噬细胞（后续称其为THP-1细胞）用不同浓度的r Msr A预处理THP-1细胞不同时间后,再用5μg/m L Mp LAMPs刺激THP-1细胞,24 h后收集细胞,ROS检测试剂盒测定细胞ROS水平。5μg/m L LAMPs刺激预先用30μg/m L r Msr A处理的THP-1细胞,24h后收集细胞,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）检测试剂盒分析细胞内SOD水平;ELISA试剂盒定量检测细胞培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。5.30μg/m L r Msr A蛋白预处理THP-1细胞1h后,再用5μg/m L Mp LAMPs刺激1h。收集细胞,Western blot检测各组细胞NF-κB p-p65和p65蛋白表达、间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）分析细胞NF-κB核转位。结果:1.构建了p ET28a（+）-msr A原核表达重组质粒,IPTG诱导DE3/p ET28a（+）-msr A重组菌表达出相对分子量（Mr）约为17 k D的可溶性重组蛋白,Western blot鉴定表达的重组蛋白为r Msr A。10μg、15μg和20μg纯化的r Msr A均能将Met O还原成Met,其酶活性较热灭活r Msr A显著增高（t=26.39,P＜0.01;t=57.28,P＜0.01;t=7.905,P＜0.05）。且15μg和20μg r Msr A还原Met O的酶活性最强。2.根据文献和生物信息学预测Mp Msr A酶活性关键氨基酸为Cys10。构建了p ET28a（+）-msr A-S10和p ET28a（+）-msr A-A10原核表达重组质粒,IPTG诱导重组菌表达出相对分子量（Mr）约为17 k D的可溶性重组蛋白。Met O还原酶活性分析显示r Msr A-S10和r Msr A-A10的酶活性较r Msr A均显著降低（t=3.868,P＜0.01;t=3.807,P＜0.01）,两种突变蛋白的Met O还原酶活性差异无显著性（t=0.330,P＞0.05）。3.4mmol/L H2O2和2mmol/L t-BHP刺激对数生长期Mp,Mp msr A基因m RNA转录水平和Msr A蛋白表达水平均较未刺激组显著升高（t=5.544,P＜0.05;t=12.75,P＜0.01）。4.预先用10～50μg/m L r Msr A处理THP-1细胞后,再用LAMPs刺激,细胞产生的ROS较LAMPs直接刺激的THP-1细胞减少,其中30μg/m L r Msr A预处理的THP-1细胞用LAMPs刺激后产生的ROS含量最低（t=35.30,P＜0.001）。用30μg/m L r Msr A预处理THP-1细胞0.5～4h后,再用LAMPs刺激,细胞产生的ROS均较未用r Msr A预处理的细胞显著降低,且r Msr A预处理1h后LAMPs刺激的THP-1细胞内ROS水平较LAMPs直接处理组显著减少（t=35.25,P＜0.001）。30μg/m L r Msr A预处理THP-1细胞1h,再用LAMPs刺激,预处理组细胞内SOD水平较未预处理的THP-1细胞显著升高（t=8.24,P＜0.05）,细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量亦较LAMPs直接刺激组细胞显著降低（t=8.21,P＜0.05;t=5.10,P＜0.05;t=12.87,P＜0.01）。5.与LAMPs直接刺激的THP-1细胞相比,30μg/m L r Msr A预处理THP-1细胞1h后再用LAMPs刺激,NF-κB p-p65水平显著降低（t=5.362,P＜0.05）,IFA结果显示细胞NF-κB核转位减少。结论:1.H2O2和t-BHP刺激可上调Mp Msr A表达,Mp Msr A可将Met O还原成Met,有抗氧化活性,Cys10为其酶活性关键氨基酸。2.Mp Msr A能抑制Mp LAMPs刺激的THP-1细胞NF-κB通路及ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。