【摘 要】
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胆红素氧化酶(Bilirubin oxidase)是一种含铜多酚氧化酶,能够将胆红素氧化为胆绿素和一些性质不是很清楚的其他物质。从微生物和植物中分离纯化出来的胆红素氧化酶,能氧化多
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胆红素氧化酶(Bilirubin oxidase)是一种含铜多酚氧化酶,能够将胆红素氧化为胆绿素和一些性质不是很清楚的其他物质。从微生物和植物中分离纯化出来的胆红素氧化酶,能氧化多种漆酶的多种底物,在环境保护领域显示出比漆酶更大的应用潜能。然而异源的胆红素氧化酶基因在植物中的异源表达却鲜有报道。本文通过对疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的胆红素氧化酶基因进行改造后,成功实现了在拟南芥中的异源表达,并完成了对表达蛋白的酶学特性及对染料脱色能力的研究,并为以植物作为生物反应器生产重组胆红素氧化酶研究奠定了基础。具体研究内容和结果如下:1、按照植物偏爱密码、RNA稳定性原则、蛋白翻译N端原则等重新设计疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的胆红素氧化酶基因,并对优化后的Mv BODI基因进行了人工合成。同时,在Mv BODI基因的5’端引入了蛋白分泌信号肽序列,便于实现在拟南芥中的分泌表达。将合成基因插入接到植物载体p CAMBIA1301,使该基因表达由强组成型启动子Ca MV35S控制。2、利用农杆菌蘸花法将Mv BODI基因导入拟南芥中,得到了具有潮霉素(HYG)抗性的阳性拟南芥转化植株,并且成功培养出能够分泌胆红素氧化酶的稳定转化株系。3、经过基因组PCR扩增、RT-PCR和Native-PAGE法检测证实Mv BODI基因已整合入拟南芥的基因组中,并在转录和翻译水平上得到了表达。4、胆红素氧化酶在拟南芥中表达的酶学特征:以胆红素为反应底物时,其最适反应温度和p H分别为60℃和7.0;以ABTS为反应底物时,其最适反应温度和p H分别为40℃和4.0。5.拟南芥的粗酶提取物能够降解结晶紫和孔雀绿两种染料,而且在以ABTS为介体的条件下,胆红素氧化酶粗酶提取物对结晶紫和孔雀绿的降解效果明显提高。同时发现转基因株系在液体培养条件下能够高效降解染料,在补加ABTS后芥对结晶紫和孔雀绿的降解率都达到了90%以上。以上结果表明,拟南芥能够高效表达出具有活性的异源胆红素氧化酶,并分泌到体外。
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