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肿瘤转移是指癌细胞从原发肿瘤中脱落,再通过血管/淋巴管转移到不同部位,并在远端部位沉降和生长的过程。肿瘤转移是癌症发病率和死亡率的主要原因,90%的癌症患者死于肿瘤转移。转移是恶性肿瘤的基本特性之一,转移与肿瘤大小、生存质量、生存时间密切相关,多数肿瘤治疗失败的原因是因为转移。目前,癌症研究主要集中于开发早诊试剂或抑制肿瘤生长的药物上,然而肿瘤转移由于影响因素众多尚未取得突破性治疗进展,全球范围内尚未有特异性抑制肿瘤转移的药物上市。在我们的前期工作中,通过高通量的方法从化合物库中筛选得到了4-甲基-3-硝基苯甲酸,能够有效抑制多种肿瘤细胞转移而不杀伤细胞。由于4-甲基-3-硝基苯甲酸活性较低,水溶性差,我们对其进行结构衍生,并筛选得到了活性更强的TCI04。首先,我们优化了TCI04的合成和纯化方法,确保其纯度大于99.9%,符合临床前药物研究的标准;然后,通过MTT增殖实验、流式细胞周期实验、小鼠急性毒性实验、大鼠亚急毒实验评价了TCI04的安全性。TCI04抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和4T1的IC50分别为2449.07和2897.64μM,对细胞周期也无明显影响。在体外药效学评价中,TCI04能够有效抑制乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、脑胶质瘤等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,并且增强肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,降低肿瘤细胞的转移能力。此外,TCI04还能通过抑制内皮细胞的运动性降低其体外成管能力。在体内B16-F10/C57人工黑色素瘤转移模型和乳腺癌模型中,TCI04能够有效抑制肿瘤转移和血管生成,延长荷瘤小鼠生存期。进一步通过基于Biacore-MS的垂钓实验发现TCI04的作用靶点为Myoferlin蛋白,K_D值为1.694±0.608μM。TCI04结合在Myoferlin的C2B功能域,抑制Myoferlin从核周向细胞膜的转位,表现出与siRNA降表达Myoferlin相似的表型,包括逆转EMT、增大黏着斑、促进应力纤维的形成等。为了进一步解析TCI04通过结合Myoferlin抑制细胞运动的分子机理,我们通过蛋白质组学的方法解析了全部与Myoferlin相互作用的蛋白,这些蛋白主要富集在蛋白的细胞器定位、应力纤维形成和解聚的过程以及Rho GTPases相关的信号通路中。进一步研究发现,TCI04可以通过两条通路升高RhoA的活性。第一条通路,TCI04与Myoferlin结合后,抑制Myoferlin与Caveolin-1的结合,影响了脂筏的形成,进而使依赖于脂筏的RND1失活,降低p190 RhoGAP的活性,减少RhoA-GTP的水解,使RhoA活性升高;第二条通路,TCI04破坏了Myoferlin与Caveolin-1的结合,使Caveolin-1不能正常自聚,使得Tyr14位点被暴露并被磷酸化,p-CAV1 Y14的含量升高并促进与之结合的RhoGEF(VAV2)的活性,促进RhoA-GDP向RhoA-GTP结合形式的转换,升高RhoA活性。总体来说,TCI04是一种低毒性的小分子化合物,能够通过结合Myoferlin并作用于其下游通路升高RhoA的活性,进而增强肿瘤细胞与基质的黏附,促进应力纤维的形成,抑制肿瘤细胞转移。TCI04有希望被开发成一种特异性阻断肿瘤转移的药物,代表着一种新的低毒性抗肿瘤疗法。