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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED),是一种病毒性肠道传染病,由PEDV引起,一般在临床上主要表现为腹泻及呕吐,可引起几乎所有年龄段猪的急性肠炎,并且对哺乳仔猪致死率较高,可达到90%以上；单克隆抗体对猪病毒性传染病的抗原结构功能分析、抗原变异研究,诊断及防治方面都具有重要意义。本研究进行了PEDV的扩增纯化及其单克隆抗体的制备及鉴定。1. PEDV抗原的增殖与纯化本试验用于扩增PEDV的细胞被选为Vero细胞。于Vero细胞上常规接毒后,在36h左右时即可出现细胞病变(CPE),在CPE达到90%时将其收取保存,反复冻融3次以后,12000r离心40min后取上清,用PEG法对其进行浓缩粗提。之后将粗提PEDV超离后取沉淀,即为试验所需免疫原。将得到的纯化样品进行鉴定：按照Reed-Muech氏法计算病毒TCID50;利用RT-PCR扩增M基因,观察其片段大小是否与经测序鉴定的PCR产物一致；进行SDS-PAGE及Western blot试验,鉴定其是否仍具有免疫反应原性。单层Vero细胞常规接种PEDV,在接种约72h后,即可达到可进行收取的CPE；接毒120h后观察发现：能使50%细胞出现病变的病毒稀释度在10-4---10-5之间,按Reed-Muench两氏法计算：TCID50=10-4.8/100μ1；纯化后的样品进行SDS-PAGE及Western blot分析,SDS-PAGE凝胶和NC膜上的蛋白条带一致,表明此样品具有免疫反应原性,可用于接下来的免疫试验；最后得到的PEDV抗原蛋白含量为4.4mg/ml。本试验成功地增殖并纯化了猪流行性腹泻病毒并对其进行鉴定,奠定了PEDV单克隆抗体制备的基础。2. PEDV单克隆抗体的制备取纯化后的PEDV抗原免疫BALB/c小鼠。利用间接ELISA法来测定免疫血清效价,当免疫血清效价大于104-105时则可进行融合。在融合前的第三天,选取血清效价水平最高的小鼠,对其进行冲击免疫,在三天后取此免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。本试验利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,再用间接ELISA方法进行初步筛选,舍去阴性孔和多细胞克隆生长的孔,选取只有一个细胞克隆生长且阳性OD450值最高者连续进行4次亚克隆。将阳性单克隆通过96孔板、24孔细胞板、6孔细胞板、细胞瓶依次扩大培养,在过程中随时冻存筛选到的阳性株。小鼠经纯化抗原免疫3次后测定,阳性血清效价都达到1：104,血清的阳性反应率为6/6。融合率在96%左右,利用间接ELISA方法进行检测,初检阳性孔数为76；阴性孔数分别为106,阳性率约41.76%。本次实验共进行了4次亚克隆,最终获得3株能稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别被命名为PEDV.1、PEDV.2、PEDV.3.本试验已成功筛选出了能稳定分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞株。3. PEDV单克隆抗体的鉴定本试验利用腹水诱导法来制备大量的抗PEDV的单克隆抗体：先用灭菌液体石腊致敏BALB/c小鼠,7-10d后再向腹腔注入0.5ml(约2.0×106个/m1)的杂交瘤细胞。观察,当小鼠腹部明显增大时抽取腹水,并测其抗体浓度。采用辛酸-硫酸铵沉淀法粗提得到的腹水,再测其蛋白浓度与粗提前进行比较。利用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞培养上清以及腹水的效价,重复3次,计算平均值。然后进行下列鉴定：抗体亚型鉴定、稳定性测定、单抗识别抗原位点的相加试验分析、单克隆抗体的特异性鉴定、相对亲和力测定。在小鼠腹腔接种杂交瘤细胞后约7d左右即可见小鼠腹部膨大,10d左右腹腔明显地胀大,应及时收取小鼠腹水。粗提前腹水蛋白浓度为603μg/ml,粗提后为14.8μg/ml,回收率2.45%。三株单抗PEDV.1、PEDV.2、PEDV.3的免疫球蛋白亚型和轻链类型经试剂盒鉴定：亚型均为IgG1,轻链为k链；3株杂交瘤细胞都具有很好的稳定性,细胞上清效价为103,腹水效价为105；相加试验证实了这3株抗PEDV的单抗针对的可能为同一个抗原位点；三株单抗都具有很好的特异性。本试验成功地制备了抗PEDV单克隆抗体并对其进行了初步的鉴定。