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先天免疫系统是机体抵御病原入侵的第一道保护屏障,其发挥作用依赖于PRRs对PAMPs的识别。TLRs是PRRs中一个重要家族,属于I型跨膜蛋白,通过识别不同的PAMPs,激活依赖MyD88或TRIF信号通路。TRIF信号通路始于TLR3识别PAMPs,随后募集并活化衔接蛋白TRIF,激活TBK1促使IRF3/7磷酸化,诱导IFN-β表达。活化的TRIF还可招募TRAF6,激活NF-κB,上调促炎细胞因子的表达水平,发挥免疫效应。卵形鲳鰺是我国南方地区重要的海水养殖品种,随着养殖规模的扩大,导致传染性疾病多发,严重影响着卵形鲳鰺养殖业的发展。鉴于TLR3信号通路在先天免疫中的重要作用,开展卵形鲳鲹TLR3鲹(TroTLR3)及其信号通路相关基因(TroTRIF、TroTRAF6和TroTBK1)的研究,将为病害防治以及抗病品种选育提供理论支撑。本研究获得了TroTLR3信号通路相关基因的全长cDNA,应用生物信息学方法预测上述基因的功能位点、三维结构;分析遗传进化规律;检测其在健康鱼体组织中的表达模式;探讨刺激条件下,免疫相关组织和非免疫相关组织中4个基因的表达规律;构建了4个基因的原核表达和真核表达重组质粒。主要研究结果如下:1、应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆TroTLR3 TroTLR3、TroTRAF、和TroTBK1基因,获得全长cDNA,长度分别为3415 bp、2297 bp、2280 bp和2482 bp。分别包含2772 bp、1770 bp、1716 bp和2172 bp的ORF,相应编码923、589、573和723个氨基酸残基。蛋白结构预测显示,TroTLR3具有11个LRR基序、3个LRR-TYP基序、1个LRR-CT基序、1个TM和1个TIR结构域；TroTRIF含有1个与TLRs类似的TIR结构域;TroTRAF6包含4个特征功能区:RING、Zf-TRAF、CC和MATH;TroTBK1 由KD、ULD和CC三个结构域构成。同源性及进化分析表明,TroTLR3、TroTRIF、TroTRAF6和TroTBK1均与其他鱼类相应的蛋白同源性较高,分别为72.2-84.8%、50.6-78.9%、84.6-91.4%和 97.4-99.4%；NJ系统发育树显示,TroTLR3、TroTRIF、TroTRAF6和TroTBK1分别与鱼类聚为一枝。表明其亲缘关系近,4个基因在不同鱼类中相对保守。2、应用 qPCR技术,检测 TroTLR3、TroTRIF、TorTRAF6和TroTBK1在健康鱼体组织(脑、鳃、胃、肠、头肾、肝脏、心脏、脾脏和肌肉)中的表达情况。结果显示,4个基因在所检组织中均有表达。其中,TroTLR3在肝脏中表达水平最高,头肾次之,在肌肉组织中表达水平最低；TroTRIF、TroaTRAF、均在肠组织中的表达水平最高,但TroTRIF在心脏组织中的表达水平最低,而TroTRAF6在肌肉组织中表达最低:TroTBK1在脾脏组织中的表达水平最高,在脑组织中的表达水平最低。这些结果表明,4个基因在免疫相关组织中的表达量高于在非免疫相关组织,暗示着TroTLR3及其信号通路相关基因在机体先天免疫反应中具有重要作用。3、LPS刺激后,TroTLR3在不同组织(头肾、脾脏、肝脏、鳃和肌肉)中的表达水平出现变化,在免疫相关组织(头肾、脾脏、肝脏和鳃)中的mRNA表达水平较对照组显著上调(P<0.05),在非免疫相关组织(肌肉)中的表达水平并未发生显著的变化。TroTRIF基因的表达水平与TroTLR3相似。TroTRAF6在被检组织(头肾、脾脏、肝脏、鳃和肌肉)中的表达水平均显著上调。TroTBK1在头肾组织中的表达水平显著上调,而在其它组织中表达水平虽有上调,但不显著。polyI:C刺激后,TroTLR3在脾脏、头肾、肝脏和鳃中的表达水平均显著上调(P<0.05)。TroTTRIF在脾脏和肝脏组织中的表达水平显著上调,并持续高水平表达;在鳃和肌肉组织中的表达水平虽有上调,但不显著。TroTRAF6在5个组织中表达水平均显著上调。TroTBK1在脾脏、头肾、肝脏和鳃中的表达水平也出现显著上调现象(P<0.05)。溶藻弧菌刺激后,TroTLR3在头肾和肌肉组织中的表达水平没有显著的变化,脾脏和肝脏中的表达水平出现显著上调。TroTRIF的表达水平在头肾、脾脏和鳃组织中出现显著上调,在肝脏和肌肉组织中没有显著变化。TroTRAF6在5个被检组织中均出现显著上调,头肾组织中的表达水平在12 h显著上调23.45倍,并持续高表达。TroTBK1在脾脏、头肾和肌肉组织中的的表达水平均出现不同程度的上调,上调1.17-5.38倍不等。这些结果表明TroTLR3信号通路相关基因参与了机体抗LPS、polyI:C和溶藻弧菌的免疫反应。4、将TroTLR3及其信号通路相关基因的ORF分别克隆至pET-32a和pEGFP-N1表达载体中,完成原核表达和真核表达重组质粒的构建。初步表达了TroTRIF和TroTRAF6蛋白,为这些基因的功能研究奠定基础。