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花色素（anthocyanin）属类黄酮化合物，是影响植物叶、花和果实着色的主要色素。调控花色素合成的转录因子主要包括三大类相互作用的蛋白，WD40、bHLH和R2R3MYB蛋白。拟南芥PAP1基因编码R2R3MYB转录因子，能激活花色素合成相关基因，促进花色素的合成和积累。课题组前期从棉花红色植株叶片中克隆了拟南芥PAP1的同源基因GhPAP1-T和GhPAP1-D。超量表达GhPAP1-D基因能有效促进烟草的各个器官（根、叶、茎、花和蒴果）的花色素合成。而GhPAP1-T基因的超量表达仅能促进烟草繁殖器官（花和蒴果）中花色素的合成。序列比较表明GhPAP1-T和GhPaP1-D在DNA结合域序列完全一致，在转录激活区存在22个氨基酸残基的差异。为进一步确定GhPAP1转录激活区的关键功能序列，本论文利用定点突变和转基因烟草研究了GhPAP1转录激活区的关键序列及其对该蛋白调控花色素合成的影响。
主要结果如下:
1.棉花GhPAP1转录激活区的关键序列
利用不对称重叠延伸PCR技术，将GhPAP1-D转录激活区180、200和220位氨基酸以后的C端序列分别替换为GhPAP1-T的相应序列，获得3个融合蛋白基因(DTS-180、DTS-200和DTS-220)。将融合蛋白基因构建组成型表达载体，并进行烟草遗传转化。融合蛋白基因DTS-200和DTS-220与GhPAP1-D相似，能促进花色素在转化愈伤和超量表达烟草叶片中合成和积累，而DTS-180和GhPAP1-T的超量表达对转化愈伤和叶片中的花色素合成无明显影响。这些结果显示GhPAP1-D转录激活区的关键序列位于第180-200位氨基酸残基之间，该序列可能在GhPAP1激活花色素合成中有着重要功能。
序列比对显示相对GhPAP1-D，GhPAp1-T在第180-200位之间存在4个氨基酸残基的变化，即N184缺失、M189→1、I198→M、N199→S。利用不对称重叠延伸PCR对GhPAP1-D序列的第184位、189位、198位和199位进行定点突变，获得4个点突变基因(DTS-184、DTS-189、DTS-198和DTS-199)，并构建到35S组成型启动子下游，进行烟草叶盘的农杆菌转化。结果显示4个点突变基因的超量表达均能促进转基因烟草愈伤和叶片合成花色素，表现出与GhPAP1-D基因一致的功能。这些结果表明在第180-200位中单个差异氨基酸残基不足以改变GhPAP1-D促进花色素合成的作用。
2.融合基因与GhPAP-D基因对花色素结构基因表达的影响
为分析GhPAP1-D基因与花色素下游结构基因的关系，用双荧光定量检测系统分析了GhPAP1-D基因及融合蛋白基因DTS-200和DTS-180与下游结构基因启动子的相互作用。结果表明，GhPAP1-D能够激活花色素下游结构基因DFR的启动子。DTS-200与GhPAP1-D表现出相同的功能，也能激活DFR启动子的表达，而DTS-180激活花色素下游结构基因DFR的启动子的效应显著的低于DTS-200和GhPAP1-D。