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[研究目的]乙型肝炎病毒(HBV)感染是人类肝细胞癌(HCC)发展的主要危险因素之一。在85%的HBV相关的HCC中都可以观察到HBV的DNA整合到基因组中。虽然大多数HBV基因在HCC组织中不表达,但在大多数HBV相关的HCC组织中检测到HBV-X(HBx)蛋白,表明HBx蛋白在HBV相关HCC的发展中起重要作用。HBx蛋白是一种多功能调节因子,与肝细胞癌的发病机制密切相关。然而,HBx蛋白致癌作用的分子机制仍未完全了解。本研究的目的是寻找与HBx调节肝癌发病相关的基因并确定其在肝癌发病机制中的临床意义,同时对干扰素IFN-α2b治疗乙型肝炎或HCC的机理进行研究,探讨IFN-α2b是否是通过抑制了 HBx相关基因的表达来对疾病进行治疗。[实验方法]1.HBx高表达细胞系的建立将携带HBx基因的慢病毒转入肝癌细胞系BEL7404使其高表达,并对其细胞功能变化进行验证,如体外增殖速度变化,体内成瘤速度变化,炎性因子释放量变化。2.HBx表达与S100A4蛋白表达水平关系验证使用基因转录组测序技术来分析高表达组与阴性对照组细胞差异表达基因。通过蛋白质印迹实验验证差异基因表达蛋白水平。将在HBx高表达细胞系中表达上调的S100A4蛋白进行shRNA敲低处理并检测细胞功能变化,以证明该差异基因与细胞功能的相关性。同时选用HBV全基因组转入的HepG2.2.15细胞系对HBV基因和S100A4的表达调控关系以及S100A4和细胞功能的关系进行进一步验证。3.分析S100A4与肝细胞癌临床预后的相关性利用免疫组化技术在180例肝细胞癌病人的癌组织中进行S100A4表达量检测,结合病人生存期验证S100A4与肝癌病人预后的相关性。[实验结果]1.HBx慢病毒转染:将携带HBx基因的慢病毒转入原代肝癌细胞中,经细胞增殖实验和裸鼠成瘤实验检测HBx高表达的细胞增殖速度明显快于对照组,且炎性因子的释放如IL-1β也呈上升趋势。2.差异基因分析:根据转录组测序分析结果筛选差异表达的基因。HBx高表达组肝癌细胞上调的基因有S100A4、IRF-7、RPS-27等;3.S100A4高表达及其功能验证3.1蛋白质印迹技术验证S100A4基因表达:S100A4是S100家族蛋白的重要成员,其功能是增加肿瘤进展和转移。经检测S100A4蛋白在HBx高表达的肝癌细胞中表达上调,提示该蛋白的高表达可能与细胞增殖速度变快有关。3.2 S100A4表达强度与细胞功能的关系:将HBx高表达组肝癌细胞中的S100A4使用shRNA进行敲低,随后进行功能验证,显示S100A4敲低后的肝癌细胞增值速度明显变慢。随后更换肝癌细胞系进行验证,得出相同的结果。3.3 S100A4表达强度与肝癌病人预后的关系:S100A4在肝癌患者的癌组织胞浆中高表达,且表达强度预生存期呈明显负相关关系。[研究结论]1.肝癌细胞中HBx过表达可以加快细胞增殖,并且转录组测序结果显示HBx过表达可以上调S100A4蛋白的表达。2.S100A4的表达与细胞增殖速度呈显著相关性,使用shRNA敲低S100A4可以导致细胞增殖变慢。提示S100A4可能有加快癌细胞增殖的作用,同时提示HBx基因可能通过调节S100A4蛋白的表达来改变细胞功能。3.S100A4在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且与肿瘤体积大小、PD-L1的表达有显著相关性。S100A4的表达与肝癌病人的临床预后有显著相关性,提示S100A4可以成为治疗肝细胞癌的良好的靶点。