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海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)属于锦葵科木槿属,是一种落叶小乔木。该植物对盐碱有较强的耐受性,能生长在碱性(p H 8.0~8.6)、含盐量高达1.5%的土壤中,是典型的盐生植物。目前有关海滨木槿耐盐性的研究主要集中在生理角度,而在分子机制方面的研究却很少。本实验从转录组和蛋白质组两方面进行分析,初步探究盐胁迫下海滨木耐盐性的分子机制,希望为更加深入的了解海滨木槿耐盐的分子调控机制和更好地推广及综合利用海滨木槿提供理论依据。1.盐胁迫下海滨木槿的转录组测序结果分析及验证用200 mM的NaCl处理长到10片真叶的海滨木槿1 d,以未处理的作为对照,取其叶和根进行转录组测序。共测序了4个样品,得到20.52 Gb Clean Data,每个样品Clean Data都达到4.50 Gb,Q30碱基百分比在93.00%及以上。组装后,共获得75,257条Unigene,其中1 kb长度以上的Unigene有17,795条。将得到的Unigene与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库进行比对,共得到44,483条Unigene的注释结果。对Unigene库进行SSR分析,共获得6,271个SSR标记。对得到的差异表达基因进行模式聚类、功能注释以及富集性分析。基于基因在不同样品中的表达量,识别差异表达基因,200 mM NaCl胁迫下转录组测序中海滨木槿处理组的叶与对照组的叶相比,得到1268个差异表达基因,其中上调的有375个基因,下调的有893个基因;而处理组的根与对照组的根相比,得到2093个差异表达基因中上调的基因有935个,下调的基因有1104个。从差异表达基因中,选取了17个基因进行荧光定量PCR验证,证明了转录组数据的可靠性,说明转录组的数据可以用来做进一步研究。2.盐胁迫下海滨木槿差异基因的表达分析及相关生理指标的测定根据转录组结果,选取了与抗盐相关的4个差异表达基因(APX、GST、SOD和AKT1),发现在盐胁迫下海滨木槿叶片中APX、GST、SOD和AKT1这四个基因的表达量都呈现先上升后下降的趋势,在3 d的时候达到最大;而在海滨木槿根中这四个基因的表达量基本上呈现出上升-下降-上升的趋势。测定200 mM NaCl处理0 d、1 d、3 d、6d、9 d的海滨木槿叶片和根中的APX、SOD、GST的酶活,发现海滨木槿叶片中APX、SOD的酶活性表现出先升高后下降的趋势,GST的酶活呈现出上升-下降-上升的趋势。APX的酶活在6d的时候达到最大,GST、SOD酶的活性在第3 d时达到最大。而海滨木槿根中APX酶活性差异却不显著,基本没有什么变化,GST的酶活基本呈现出下降的趋势,SOD酶的活性则表现出先升高后降低的趋势,在第6 d时酶活性最大。以上结果说明海滨木槿在遭受盐胁迫时,抗性基因最先做出响应,然后再通过转录翻译合成相关的抗性蛋白,从而使植物抵抗环境胁迫。测定200 mM的NaCl处理0 d、1 d、3 d、6 d、9 d的海滨木槿叶片和根中的Na+、K+含量,发现海滨木槿叶片中Na+的含量随着时间的延长是逐渐升高的,K+含量则表现出先升高后降低的趋势;海滨木槿根中Na+的含量随着时间的延长逐渐升高,K+含量则表现出逐渐降低的趋势。3.盐胁迫下海滨木槿的蛋白质组研究用200 mM的NaCl处理海滨木槿,以不含NaCl的1/2 Hoagland营养液浇灌为对照,取胁迫1 d的海滨木槿的叶提取总蛋白,进行双向电泳,每个样品进行三次技术重复。使用PDQuest软件对图像进行分析,对蛋白丰度表达差异为P≤0.05且ANOVE≥2的点标记,发现在盐胁迫下,与对照相比,200 mM的NaCl处理1 d后的海滨木槿叶中有86个蛋白质点表现出显著性差异,其中蛋白质丰度增加的有54个,蛋白质丰度降低的有32个。对这些差异蛋白点进行质谱分析,总共检测出77种差异蛋白,其中48种是上调的,29种是下调的。对这些差异蛋白进行GO富集分析和Pathway富集分析,将这些差异蛋白进行分类,主要分类到光合、代谢、蛋白质折叠、蛋白质加工、合成和降解、能量、信号传递及抗氧化等过程中。以上发现暗示这些蛋白在海滨木槿应答盐胁迫中可能发挥着重要的作用。