泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）介导真核生物体内具有高度选择性的蛋白质降解，2004年的诺贝尔化学奖授予了这一途径的发现者。泛素（ubiquitin，Ub）是由76个氨基酸残基组成的在各种物种中极为保守的蛋白，因其广泛存在而得名。蛋白质泛素化由泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitinconiugatingenzyme，E2）和泛素连接酶（ubiquitin protein ligase，E3）通过一系列的级联反应完成。蛋白质泛素化的异常与癌症、神经退行性疾病等密切相关，美国FDA最近批准将蛋白酶体广泛抑制剂Velcade用于多发性骨髓瘤的治疗。由于E3决定底物特异性，因此成为癌症等相关疾病治疗研究中更加富有前景的靶分子。据估计，人类基因组含有1000个左右的E3分子，数量远远超出E1、E2。E3研究是蛋白质泛素化研究领域的重点，其中的三个核心科学问题是：（1）E3功能分子的组织模式及活性调控机制；（2）鉴定新的E3及其底物，揭示其生物学功能；（3）E3如何决定底物的特异性。按照结构特点，E3可以分成两大类：含有RING（really interesting new gene）锌指结构和HECT（homologous to E6AP C-terminus）结构域的E3，虽然也有很少数的E3含有其他结构域，如U-box、PHD结构域，但是由于它们所占的比例非常小，因此认为E3的主要类型就是RING和HECT两大类。对于前者的研究比较多，但是对于HECT类泛素连接酶的研究国际上目前的特点是，功能研究的主要进展是近十年获得的，因此了解还不深入；同时，研究多关注功能研究，对于其活性调控研究才刚刚开始不久，因此又是一个崭新的研究领域。　　 对HECT类E3的了解绝大部分来自于对一个称为Nedd4（neural precursor cells-expresseddevelopmentally down-regulated4）家族的研究。Smurfl（Smad ubiquitination regulatory factor1）是HECT类E3 Nedd4家族中的主要成员，主要介导成骨细胞中BMP信号通路中蛋白分子的降解。人源Smurf1蛋白编码731个氨基酸，Smurf1最早于1999年在寻找Smad1相互作用分子时被克隆，它是发现的第一个可以降解R-Smads（Smad1/5）的E3，这使得TGF-β/BMP通路与泛素-蛋白酶体降解通路联系起来。同时有报道指出，Smurf1可以与I-Smads（Smad6/7）相互作用，同时抑制BMP信号通路。Smuff1除了Smads外，体外实验还揭示Smurf1可降解。Runx2、RhoA，调控成骨细胞分化和细胞极性。鉴于其功能重要性，Smurf1一经发现就引起高度关注。　　 Smurf1分子如此重要，对其调控机制的研究目前只有一篇文章对其报道，就是本实验室发现的CKIP-1分子通过与Smurf1的WW结构域连接区相互作用，从而增强Smurf1泛素化降解底物的活性。所以为了寻找Nedd4家族成员Smurf1新的调控分子和新的调控机制，本实验室以Smurf1的△C2结构域为诱饵蛋白，从成人的肝脏文库中筛选到一个我们感兴趣的分子FBXL15。FBXL15（F-box and leucine-rich repeat protein15）分子是F-box蛋白家族成员之一，它含有300aa，除其N端具有一个特有的F-box基序外，其C端是6个亮氨酸富含区。在真核生物中广泛存在着一类被称为F-box的蛋白家族，该蛋白家族的共同特征是含有F-box结构域。F-box蛋白在泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）中的作用十分重要。目前国内外对F-box蛋白的研究主要是围绕UPP展开的。UPP中，E1和E2中存在高度保守的序列结构，易于识别，而E3的结构差异很大，很难从数据库中鉴定出这一类分子。E3常以多蛋白亚基复合物的形式完成底物蛋白的识别及E2的招募作用，因此E3在这个过程中起着关键的作用。E3主要分为PHD-finger家族、HECT家族、Ring-finger家族和U-box家族等几大类。SCF复合体则是Ring-finger家族中最重要且研究最多的一种E3，主要有4种成分组成：结合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin、Ring-finger和蛋白Rbx1以及一种F-box蛋白。前3种蛋白构成组成成分稳定单一的骨架，用来与不同的F-box蛋白结合，F-box蛋白又通过C端来特异识别不同的底物蛋白。作为SCF复合体的重要成分，F-box蛋白通过参与UPP在细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡和信号转导等过程中发挥了重要的功能。　　 本文通过GST pull-down实验确证FBXL15可以与Cullin1、Skp1、Roc1相互作用，形成SCF复合体，发挥RING类泛素连接酶的功能。随后我们通过体内外泛素化实验证明SCFFBXL15可以泛素化调控Smurf1，并且精确确定该泛素化修饰的位点主要位于Smurf1的WW和HECT连接区第357位的赖氨酸残基，这是第一次发现该区域可被靶向调控，同时也是首次揭示Smurf1的泛素化位点。同时，我们通过氨基酸序列比对和实验验证，发现SCFFBXL15特异性调控Nedd4家族中的Smurf1和Smurf2。随后通过报告基因实验表明SCFFBXL15通过泛素化调控Smurf1可以增强BMP通路活性。这是第一次发现Smurf1这类HECT类的E3可以被SCF这类RING类的E3进行反式泛素化降解，丰富E3的调控机制。